人工腎小球?yàn)V過(guò)膜的初步研究.pdf

1、第一部分：多聚硅裂孔薄膜微結(jié)構(gòu)支架制備
　　背景：腎臟的主要功能是排泄代謝廢物，調(diào)節(jié)水電解質(zhì)和酸堿平衡，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。為此，它首先需要將血液進(jìn)行選擇性濾過(guò)，然后再通過(guò)腎小管的重吸收和分泌功能來(lái)完成這一功能。目前體外模擬腎臟功能的常用方法是血液透析，其核心部件則是透析膜。臨床廣泛應(yīng)用的血液透析膜是一種高分子材料，通過(guò)紡絲工藝加工而成，這類(lèi)膜均存孔徑不均一，大小不等，厚度常有數(shù)十微米，且很難進(jìn)一步壓縮其體積，也很難進(jìn)一步添加其他

2、處理元件，如感受器、微型開(kāi)關(guān)等。為此，我們希望能選用一種全新的材料和工藝，以制造一種全新的濾過(guò)膜，以便更好的模擬腎小球?yàn)V過(guò)膜，并希望未來(lái)能在此膜上增加其他處理元件，如容量感受器，微型馬達(dá)、開(kāi)關(guān)等元件。
　　方法：我們選用MEMS工藝，利用硅為主要支架，金屬作為多孔隙薄膜這樣一個(gè)整體框架，該支架結(jié)構(gòu)以硅作為支架基底，在硅支架底面開(kāi)矩形陣列窗口，在硅支架表面制備金屬濾過(guò)膜。濾過(guò)膜結(jié)構(gòu)中包含濾過(guò)膜孔，其結(jié)構(gòu)可以自由選擇，而不僅限于圓孔狀

3、結(jié)構(gòu)。具體步驟為：1、選擇雙面拋光并氧化處理的硅片作為基片，通過(guò)高能離子束物理轟擊，以去除基體表面吸附的顆粒及有機(jī)污染物；2、采用Karl Suss公司RC8型甩膠臺(tái)進(jìn)行甩膠，控制膠厚度為5微米；3、采用一定的烘溫程序?qū)饪棠z進(jìn)行烘烤；4、采用Karl Suss MA6/BA6雙面光刻機(jī)對(duì)光刻膠進(jìn)行曝光。采用“F”型對(duì)準(zhǔn)標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)掩膜與基片之間的對(duì)準(zhǔn)，以此確保各層圖形的精確對(duì)準(zhǔn)。曝光光線為波長(zhǎng)4000A的紫外光，曝光功率為275瓦，曝光

4、方式為掩膜版與光刻膠表面直接接觸的接觸式曝光，這樣可以得到較高的分辨率，減少圖形失真；5、采用固定浸沒(méi)式顯影，以便對(duì)經(jīng)過(guò)曝光，溶解性發(fā)生變化的、已“潛影”的光刻膠進(jìn)行選擇性溶解。光刻膠經(jīng)過(guò)顯影后用去離子水清洗基片并將基片旋轉(zhuǎn)甩干，去除顯影后殘留在基片表面的所有化學(xué)藥品。然后通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡檢查顯影的效果。如果顯影參數(shù)控制不當(dāng)，顯影圖形可出現(xiàn)缺陷以至影響后續(xù)工藝。如有明顯顯影缺陷，則將基片去膠后重新進(jìn)行甩膠與光刻工藝；6、光刻膠經(jīng)過(guò)顯影

5、、清洗后，在烘箱中進(jìn)行烘培堅(jiān)膜處理，隨后在空氣中自然冷卻。7、采用濕法刻蝕工藝以選擇性刻蝕二氧化硅，刻蝕液為氫氟酸刻蝕液。8、在另一面分別濺射鉻和銅，其中鉻是用于鍵合多金屬層的粘結(jié)層，而銅為電鍍種子層。9、再次通過(guò)旋涂光刻膠、曝光、顯影等步驟進(jìn)行圖像轉(zhuǎn)移，然后電鍍鎳以形成濾過(guò)膜，10、去除殘余的光刻膠；11、分別刻蝕硅和二氧化硅；在對(duì)硅進(jìn)行刻蝕時(shí)，選用氫氧化鉀堿性溶液作為硅的濕法刻蝕溶液。12、最后電鍍金。
　　結(jié)果：我們基于標(biāo)準(zhǔn)

6、MEMS工藝對(duì)以硅為基礎(chǔ)的材料進(jìn)行圖形化、刻蝕、濺射、電鍍等一系列加工，在加工期間，對(duì)各項(xiàng)加工參數(shù)進(jìn)行了仔細(xì)的優(yōu)化，摸索出一套適合本研究的條件。最終，在我們所設(shè)計(jì)的硅支架上面形成了一層多孔隙薄膜，該膜厚度約為2-3微米，為了后續(xù)研究方便，我們將它切割成1cm×1cm或2cm×2cm大小的方形硅片。最后將所有樣品均置于顯微鏡下，仔細(xì)觀察孔徑形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：硅支架強(qiáng)度高，表面膜結(jié)構(gòu)完整，其孔隙形態(tài)規(guī)整，大小一致，完全符合設(shè)計(jì)要求。

7、>　　結(jié)論：MEMS工藝制備的濾過(guò)膜孔隙完全規(guī)整，其大小、形狀分布等均可以根據(jù)要求進(jìn)行自由設(shè)計(jì)和改變，薄膜的厚度約為2-3微米，同時(shí)具有較高的強(qiáng)度。
　　第二部分：多聚硅裂孔薄膜的生物相容性和細(xì)胞毒性研究
　　前言：所有和體液接觸或計(jì)劃植入體內(nèi)的材料，必須保證生物相容性良好。而且，為了更好的模擬腎小球功能，我們計(jì)劃在此多聚硅裂孔薄膜上培養(yǎng)足細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。為此，我們首先需要了解該人工濾過(guò)膜對(duì)細(xì)胞的生物相容性，并了解細(xì)胞能否在

8、該人工濾過(guò)膜上粘附、增生、分化并發(fā)揮其功能。
　　材料與方法：前期合成的多聚硅裂孔薄膜經(jīng)檢驗(yàn)合格，用稀鹽酸浸泡，以清除前期加工過(guò)程中可能殘留的各種雜質(zhì)，然后采用常規(guī)消毒滅菌。晾干后分別給予Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原和Laminin包被，然后通過(guò)掃描電鏡觀察包被液對(duì)孔徑大小的影響。我們?cè)谠摫∧ど线M(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，觀察包被前后細(xì)胞增生情況。并觀察培養(yǎng)時(shí)死活細(xì)胞比例，同時(shí)通過(guò)MTT試驗(yàn)了解該薄膜對(duì)細(xì)胞是否存在一定毒性作用。隨后我們觀察了在該薄膜上培

9、養(yǎng)系膜細(xì)胞/MDCK細(xì)胞時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)(纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原)和炎性因子(IL-1BETA和TNFalpha)的分泌情況。最后，通過(guò)掃描電鏡觀察了MDCK細(xì)胞的形態(tài)。
　　結(jié)果：1、我們?cè)陔婄R下分別觀察了多聚硅裂孔薄膜在細(xì)胞外基質(zhì)包被前后孔徑大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞外基質(zhì)包被前后膜孔徑并沒(méi)有改變；2、我們的研究表明，當(dāng)孔徑為15μm或以上時(shí)，細(xì)胞很難在膜上粘附、生長(zhǎng)，增殖，當(dāng)我們縮小膜孔徑后發(fā)現(xiàn)，在不對(duì)多聚硅裂孔薄膜預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞外

10、基質(zhì)包被的情況下，細(xì)胞仍表現(xiàn)為粘附稀疏，培養(yǎng)困難。而預(yù)先予細(xì)胞外基質(zhì)包被后，則細(xì)胞容易粘附，增生，并較容易形成單層融合。3、不同包被基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)作用并不完全相同，其中l(wèi)v型膠原包被組在細(xì)胞培養(yǎng)初始階段(1-2天時(shí))就有明顯的增生，且與其他組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組間差異消失。細(xì)胞數(shù)量在第4天時(shí)達(dá)到一個(gè)頂峰，而進(jìn)一步延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，則細(xì)胞數(shù)量有下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖2-3)。4、在多聚硅裂孔薄膜上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)

11、，在增殖階段，死細(xì)胞數(shù)約占總細(xì)胞數(shù)量的5-13％，這與普通玻璃上培養(yǎng)時(shí)非常類(lèi)似。提示該薄膜對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用，并不促進(jìn)細(xì)胞死亡；MTT試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。5、在多孔隙薄膜上培養(yǎng)系膜細(xì)胞時(shí)，炎癥因子IL-1beta和TNF-ALPHA的釋放并不明顯，與普通培養(yǎng)條件類(lèi)似(IL-1BETA：136.5±20.2Vs134.2±28.5ng/ml；P>0.05；TNFALPHA；107.3±21.6VS119.0±18.2，P>0.0

12、5)；而在給與脂多糖刺激后，人系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-ALPHA明顯增多《689.0±31.7，658±45.3，和對(duì)照組相比，P<0.05)。6、我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)上清液中，檢測(cè)到游離的Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白。多聚硅裂孔薄膜對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成沒(méi)有明顯的刺激或削弱作用。7、掃描電鏡觀察結(jié)果表明，培養(yǎng)約3-4天后，MDCK細(xì)胞就基本形成了扁平融合的單層細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與常規(guī)培養(yǎng)類(lèi)似。進(jìn)一步培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)量并不再增加，但細(xì)胞由既往

13、的扁平狀變成了立方狀，細(xì)胞與細(xì)胞之間結(jié)合緊密，頂端有大量微絨毛形成，提示其功能活躍。
　　結(jié)論：我們的研究表明，基于MEMS工藝所制成的多孔隙薄膜對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒副作用，不刺激細(xì)胞釋放炎性因子，不促進(jìn)細(xì)胞的死亡。對(duì)該薄膜預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)包被，將明顯促進(jìn)細(xì)胞的粘附，生長(zhǎng)，增殖。經(jīng)過(guò)表面修飾后，MDCK細(xì)胞和系膜細(xì)胞能在該多孔隙薄膜上粘附、生長(zhǎng)，增殖、分化，且形態(tài)完好，提示其功能正常。
　　第三部分：濾過(guò)性能測(cè)定
　　

14、前言：目前研究表明，腎小球?yàn)V過(guò)屏障主要由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和足細(xì)胞構(gòu)成，足細(xì)胞在其中發(fā)揮著非常重要的作用。因此，我們?cè)诙嗑酃枇芽妆∧ど吓囵B(yǎng)足細(xì)胞，并檢測(cè)了這一復(fù)合膜的濾過(guò)性能。
　　方法：在多聚硅裂孔薄膜上培養(yǎng)永生化的足細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)薄膜后，將其放入自制測(cè)定小室中，薄膜一側(cè)為含不同分子量的溶質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)液流過(guò)，然后檢測(cè)流入、流出液中各種溶質(zhì)的濃度，并檢測(cè)濾過(guò)液的量，以計(jì)算其濾過(guò)分?jǐn)?shù)和溶質(zhì)的表觀清除率。
　　結(jié)果：1、在本

15、研究中，我們通過(guò)調(diào)節(jié)氣泵將跨膜壓設(shè)定為10mmHg，通過(guò)蠕動(dòng)泵將細(xì)胞培養(yǎng)液的流入速度恒定為2ml/min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定時(shí)間內(nèi)，濾過(guò)液的流速基本恒定為0.52±0.07ml/min。提示該膜的濾過(guò)分?jǐn)?shù)約為26％。我們測(cè)得維生素B12的表觀清除率為1。白蛋白表觀清除率約為0.136，人免疫球蛋白lgG表觀清除率約為0.019。2、通過(guò)調(diào)節(jié)氣泵改變?yōu)V過(guò)膜的跨膜壓力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)跨膜壓大于40mmHg時(shí)，一般均能在濾過(guò)液中檢查到紅細(xì)胞，提示

16、在此壓力下較容易出現(xiàn)破膜現(xiàn)象，而在20mmhg以下時(shí)，多次檢測(cè)濾過(guò)液，均未發(fā)現(xiàn)有明顯紅細(xì)胞存在。提示在此壓力下，不易出現(xiàn)破膜。3、在液體流量為2ml/min，跨膜壓為10mmHg的情況下，循環(huán)2小時(shí)后，取細(xì)胞培養(yǎng)液及濾過(guò)液，結(jié)果未能在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)脫落的足細(xì)胞，但如果將時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，則有時(shí)可在細(xì)胞培養(yǎng)液中找到脫落的足細(xì)胞。
　　結(jié)論：多聚硅裂孔薄膜培養(yǎng)足細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液的濾過(guò)分?jǐn)?shù)為26％。該生物人工復(fù)合膜對(duì)小分子物質(zhì)能完全濾過(guò)，但