TNFα引起肝腎綜合征腎小球?yàn)V過率下降的機(jī)制研究.pdf

1、本研究采用腫瘤壞死因子α(TNFα)處理原代培養(yǎng)的GMCs，檢測(cè)其對(duì)胞漿Ca<'2+>濃度、細(xì)胞收縮程度、IP<,3>RI蛋白、IP<,3>RI mRNA表達(dá)水平及IP<,3>RI啟動(dòng)子活性的影響，探討TNFα在其中的作用；同時(shí)探究TNFα對(duì)PKCα活性的影響，以及PKCα在TNFα-IP<,3>RI mRNA表達(dá)增加中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，為HRS時(shí)GFR下降的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。 研究材料與方法： 1、材料： 選

2、擇雄性Wistar大鼠，原代分離大鼠腎小球系膜細(xì)胞，并置于10％FCSDMEM培養(yǎng)液，37℃CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)2周后常規(guī)傳代，經(jīng)倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定及免疫熒光抗α-肌動(dòng)蛋白抗體染色陽(yáng)性、抗角蛋白抗體染色陰性鑒定為系膜細(xì)胞，取3-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2、方法： (1)分組：分組1：TNFα處理0h、2h、4h、8h、24h組；分組2：對(duì)照組(D組)、TNFα處理8h組(T組)、L-蘇式二氫神鞘氨醇(safi

3、ngol)處理8h組(S組)、TNFα與safingol共處理8h組(TS組)。每組設(shè)2個(gè)樣本，并用不同代細(xì)胞重復(fù)4次。 (2)應(yīng)用Fluo-3/AM熒光標(biāo)記技術(shù)及共聚焦顯微鏡檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度動(dòng)態(tài)變化，觀察TNFα對(duì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的影響。 (3)通過對(duì)收縮前、后的GMCs表面積進(jìn)行測(cè)量得出細(xì)胞收縮的幅度，借以探討TNFα對(duì)GMCs收縮敏感性的影響。 (4)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、Westem b

4、lot、Real-time PCR方法檢測(cè)TNFα對(duì)GMCs中Ⅰ型IP<,3>R蛋白及其mRNA表達(dá)的影響。 (5)將重組質(zhì)粒PGL<,3>-IP<,3>R<,1>promoter轉(zhuǎn)染GMCs，通過檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(luc)報(bào)告基因的表達(dá)活性，說(shuō)明TNFα對(duì)IP<,3>RI啟動(dòng)子活性的影響。 (6)應(yīng)用免疫熒光、體外磷酸化、Western blot方法研究TNFα對(duì)PKCα活性及PKCα蛋白表達(dá)的影響。 (7)

5、用Real-time PCR方法檢測(cè)抑制PKCα活性對(duì)TNFα上調(diào)IP<,3>RI mRNA表達(dá)的影響。 研究結(jié)果： 1、[Ca<'2+>]i測(cè)量結(jié)果Fluo-3/AM標(biāo)記后顯示，內(nèi)皮素(ET)刺激可使GMCs胞內(nèi)鈣離子濃度在短時(shí)間內(nèi)有個(gè)迅速、顯著的增加。TNFα孵育4h、24h組上述效應(yīng)明顯增強(qiáng)，兩組[Ca<'2+>]i上升幅度與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p<0.05)，但TNFα處理4h與24h無(wú)顯著差異(p>0.0

6、5)。上述效應(yīng)可被2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)完全阻斷。 2、GMCs表面積測(cè)量結(jié)果對(duì)照組加入ET約lmin時(shí)，即出現(xiàn)可見的細(xì)胞收縮變化；4min時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化最為明顯，細(xì)胞面積明顯縮小。TNFα孵育4h、24h組上述效應(yīng)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞面積縮小的更加明顯，以24h組為著，兩組與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.01)。 3、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Ⅱ型IP<,3>R結(jié)果Ⅰ型IP<,3>R主要分布于GMCs的胞漿內(nèi)，以靠細(xì)胞核附

7、近的胞漿分布較為集中，在對(duì)照組表達(dá)水平較低。TNFα孵育4h-24h組均可發(fā)現(xiàn)棕褐色陽(yáng)性信號(hào)增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比增加，以24h時(shí)最為明顯，各組與對(duì)照組比較差異顯著(p<0.05)。 4、Western blot定量分析Ⅰ型IP<,3>R表達(dá)對(duì)照組Ⅰ型IP<,3>R表達(dá)水平較低；TNFα處理4h-24h組與對(duì)照組相比Ⅰ型IP<,3>R蛋白的表達(dá)明顯增高，以24h最為明顯，與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)。 5、實(shí)時(shí)定

8、量PCR檢測(cè)I型IP3RmRNA表達(dá)TNFα處理2h-24h組與對(duì)照組相比，Ⅰ型IP<,3>RmRNA的表達(dá)增高，以TNFα處理8h時(shí)最為明顯，差異顯著(P<0.05)。 6、IP<,3>RI啟動(dòng)子活性檢測(cè)在對(duì)照組GMCs內(nèi)，Ⅰ型IP<,3>R啟動(dòng)子活性很弱；TNFα處理4h-24h組，Ⅰ型IP<,3>R啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，以TNFa處理8h最為明顯，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。 7、免疫熒光檢測(cè)PKCα的分布

9、對(duì)照組PKCα定位于胞漿內(nèi)，呈散在分布； TNFα處理8h-24h組，PKCα轉(zhuǎn)位于核周分布且部分轉(zhuǎn)位于核內(nèi)分布。 8、免疫沉淀后PKCα活性檢測(cè)對(duì)照組即存在相當(dāng)活性的PKCa：TNFα處理8h-24h組PKCα活性明顯增強(qiáng)，以TNFα處理8h最為顯著(P<0.05)。 9、Westem blot定量分析PKCα蛋白表達(dá)GMCs中PKCα蛋白呈高水平表達(dá)，但PKCα蛋白的表達(dá)在TNFα處理各組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(p>0

10、.05)。 10、Real-time PCR方法分析PKCα抑制劑對(duì)TNFα上調(diào)Ⅰ型IP<,3>RmRNA表達(dá)的影響T組Ⅰ型IP<,3>RmRNA呈高水平表達(dá)；TS組與T組相比，Ⅰ型IP<,3>R mRNA的表達(dá)明顯下降，差異顯著(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、TNFα可增加ET刺激引起的胞內(nèi)鈣離子濃度。 2、TNFα增加ET刺激引起的胞內(nèi)鈣離子濃度是通過IP<,3>Rs來(lái)產(chǎn)生效應(yīng)的。 3、T

11、NFα對(duì)ET引起的GMCs收縮起著協(xié)同作用。 4、TNFα處理的GMCs中，IP<,3>RI蛋白的表達(dá)及IP<,3>RImRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且IP<,3>RI mRNA表達(dá)的上調(diào)在時(shí)相上先于IP<,3>RI蛋白的上調(diào)，說(shuō)明TNFα可在IP<,3>RI mRNA的轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控。 5、TNFα處理的GMCs中，Ⅰ型IP<,3>R啟動(dòng)子活性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明其可通過增強(qiáng)Ⅰ型IP<,3>R啟動(dòng)子活性來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄I型IP<,