小鼠Qa-1有效干擾片段的篩選.pdf

1、人類主要組織相容性抗原Ⅰ類分子包括經(jīng)典HLA-A、B、C分子和非經(jīng)典HLA-E、G、F分子兩大類。其中非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子在免疫系統(tǒng)中所起的作用目前已成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。HLA-E是一類非經(jīng)典的MHC-Ⅰ類分子，具有廣泛的組織分布和低水平表達(dá)的特點(diǎn)，HLA-E分子的細(xì)胞表面表達(dá)有賴于MHC-Ⅰ類分子(HLA-A.-B.-C和-G)衍生的先導(dǎo)序列多肽的存在，作為NK細(xì)胞受體CD94/NKG2的配體，它調(diào)節(jié)人類自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞的

2、功能，在母胎免疫，腫瘤免疫，病毒感染的免疫逃避以及移植免疫中具有重要作用。 HLA-E的鼠源類似物為Qa-1，具有有限的多態(tài)性，廣泛的組織表達(dá)，而細(xì)胞表面表達(dá)比較低。Qa-1結(jié)合一種肽，來(lái)源于H-2D，稱為Qdm，共同表達(dá)于細(xì)胞表面，Qa-1-Qdm復(fù)合物可被NK細(xì)胞和一部分T細(xì)胞的CD94/NKG2所識(shí)別。與人類細(xì)胞相似，Qa-1與CD94/NKG2-A結(jié)合傳遞抑制信號(hào)，起抑制NK細(xì)胞的作用，與CD94/NKG2-C結(jié)合則激活

3、NK細(xì)胞。但在小鼠細(xì)胞，CD94/NKG2-C受體的合成量少于CD94/NKG2-A，Qa-1與Qdm結(jié)合并不是唯一的，Qa-1也可與其它多肽結(jié)合而被CD94/NKG2識(shí)別，只是Qdm有最佳的結(jié)合結(jié)構(gòu)。與HLA-E相似，Qa-1在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞，T細(xì)胞功能，腫瘤免疫，病毒感染，自身免疫，移植免疫中起重要作用。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指由19～23堿基對(duì)的短雙鏈RNA，即小干擾RNA(smallin

4、terferingRNA，siRNA)在真核細(xì)胞中引導(dǎo)序列特異性的內(nèi)源或外源性靶mRNA降解，進(jìn)而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的現(xiàn)象。因其高度的特異性，高效性得到廣泛應(yīng)用，目前有包括化學(xué)合成法在內(nèi)的幾種制備方法，其中利用載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可以達(dá)到使siRNA傳代的目的。 綜上所述，Qa-1在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其在異基因造血干細(xì)胞移植中的作用還有待研究，利用RNA干擾這一新型高效的基因敲除技術(shù)，可以幫助我們進(jìn)一步研究Qa-1在異基因造血干

5、細(xì)胞移植中的具體作用，為臨床增加干細(xì)胞植入，防治GVHD提供新策略。本課題將利用RNA這一新型高效的基因敲除技術(shù)初步篩選小鼠Qa-1最有效的干擾片段，為進(jìn)一步研究Qa-1在免疫調(diào)節(jié)中的作用，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用于臨床異基因造血干細(xì)胞移植奠定基礎(chǔ)。 材料和方法1.構(gòu)建三個(gè)針對(duì)小鼠Qa-1的小發(fā)夾表達(dá)質(zhì)粒在GeneBank查出小鼠Qa-1mRNA全序列，通過(guò)美國(guó)Ambion公司提供的siRNAweb設(shè)計(jì)工具，依據(jù)設(shè)計(jì)原則，選擇三段針對(duì)

6、Qa-1的siRNA靶位：GACTCGGAGAATCCGAAGA；AATCAGAGTAAGGACGAATCT；AACAAAGCTGTTCTGCTTGTC分別位于186，327，929位，交由晶賽公司合成三段針對(duì)Qa-1的小發(fā)夾結(jié)構(gòu)，分別在合成片段兩端添加BamHⅠ及SalⅠ酶切位點(diǎn)，真核載體pGenesil-2經(jīng)BamHⅠ，SalⅠ雙酶切，與發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接，合成小發(fā)夾表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒帶有新霉素篩選標(biāo)記，卡那抗性。以紫外分光光度計(jì)測(cè)定小發(fā)夾表

7、達(dá)質(zhì)粒的濃度，純度，并交由博亞公司酶切測(cè)序。 2.篩選出最有效抑制Qa-1基因的siRNA靶位小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3分為四組培養(yǎng)，n=6，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，前三組分別轉(zhuǎn)染三個(gè)小發(fā)夾表達(dá)質(zhì)粒，濃度為H2-T2311.2μg/μL；H2-T2321.3μg/μL；H2-T2330.8μg/μL，第四組細(xì)胞單純加入脂質(zhì)體作為陰性對(duì)照。分別收集轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)的細(xì)胞，提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR法擴(kuò)

8、增出目的片段，半定量分析Qa-1在RNA水平的改變，同樣收集轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)的細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，應(yīng)用抗Qa-1的特異性單抗對(duì)Qa-1的細(xì)胞表面表達(dá)進(jìn)行分析。 結(jié)果1.構(gòu)建三個(gè)針對(duì)小鼠Qa-1的小發(fā)夾表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)美國(guó)Ambion公司提供的siRNAweb設(shè)計(jì)工具，得到多條siRNA靶位序列，依據(jù)設(shè)計(jì)原則，選取三條，交由武漢晶賽公司合成小發(fā)夾表達(dá)質(zhì)粒，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的濃度，純度，濃度為H2-T23

9、11.2μg/μL；H2-T2321.3μg/μL；H2-T2330.8μg/μL，將質(zhì)粒交付博亞公司鑒定測(cè)序，結(jié)果與所選取片段序列一致。 2.篩選最有效抑制Qa-1基因的siRNA靶位體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或菱形，帶有干擾片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，部分變圓，通過(guò)RT-PCR及流式細(xì)胞儀技術(shù)，證實(shí)轉(zhuǎn)染前NIH3T3細(xì)胞表達(dá)一定水平Qa-1，轉(zhuǎn)染后Qa-1在RNA水平及細(xì)胞表面均減低了表達(dá)

10、，24h，48h，72h三組細(xì)胞Qa-1減低分別達(dá)H2-T231：60.9％，81.9％，43.6％；H2-T232：64.5％，73.9％，61.1％；H2-T233：61.9％，71.2％，47.5％.減低的程度不一，其中H2-T232組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)減低最明顯。 結(jié)論1.通過(guò)設(shè)計(jì)工具，依據(jù)設(shè)計(jì)原則，選擇三段針對(duì)Qa-1的siRNA靶位，在真核載體pGenesil-2上成功構(gòu)建Qa-1特異性的小發(fā)夾表達(dá)質(zhì)粒。 2.用脂