慢病毒介導(dǎo)的sFlt-1基因片段轉(zhuǎn)移對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的阻遏作用.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、攜帶sFlt-1基因不同片段的慢病毒載體的構(gòu)建及表達(dá) 目的：建立攜帶可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1（sFlt-1）不同基因片段的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究sFlt-1蛋白生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 方法：以人新鮮胎盤組織提取的cDNA為模板，分別選取sFlt-1第2-3及第2-4免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)編碼序列設(shè)計引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制備sFlt-1基因片段sFlt-1（2-3）和sFl

2、t-1（2-4）。擴(kuò)增片斷經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI雙酶切后，插入慢病毒載體pRRL-GFP中，構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pRRL/sFlt-1（2-3）及pRRL/sFlt-1（2-4），分別與慢病毒包裝載體pMDLg/pRRE、包被載體PRSV/REV、pMD2.G共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK293T)，獲得重組慢病毒Lenti.sFlt-1（2-3）及Lenti.sFlt-1（2-4），并感染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，通過RT-PCR和W

3、estern blot檢驗Lenti.sFlt-1（2-3）及Lenti.sFlt-1（2-4）在人類細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實pRRL/sFlt-1（2-3）和pRRL/sFlt-1（2-4）的序列與Genebank 完全相同，包裝成病毒后能有效感染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。 結(jié)論：本實驗成功構(gòu)建了分別攜帶sFlt-l基因第2-3和第2-4免疫球蛋白樣區(qū)域編碼序列的慢病毒載體，包裝成病毒后能有效感染人類細(xì)

4、胞，為今后視網(wǎng)膜新生血管疾病的基因治療提供了新的可能途徑。 第二部分、小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型的建立及鑒定 目的：建立穩(wěn)定可靠的視網(wǎng)膜新生血管動物模型，為今后探究視網(wǎng)膜新生血管疾病的治療方法奠定模型基礎(chǔ)。 方法：將新生C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組和模型組。將模型組小鼠于生后第7 天置于75％氧濃度環(huán)境，生后第12 天返回正?？諝庵?；正常組小鼠則始終置于正?？諝猸h(huán)境喂養(yǎng)。至小鼠生后第17 天進(jìn)行心臟熒光素灌注造

5、影視網(wǎng)膜鋪片和眼球連續(xù)切片蘇木精-伊紅（H-E）染色鑒定視網(wǎng)膜新生血管生成情況。 結(jié)果：模型組小鼠心臟熒光素灌注造影視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)域無灌注缺血，另外視網(wǎng)膜有明顯的異常表現(xiàn)諸如血管迂曲擴(kuò)張、熒光滲漏等。眼球連續(xù)切片H-E 染色發(fā)現(xiàn)模型組小鼠視網(wǎng)膜有許多突出內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核，計數(shù)為平均48.65±6.24 個/片/眼，而正常組小鼠為平均0.38±0.21 個/片/眼，兩組比較P<0.01。 結(jié)論：氧誘導(dǎo)

6、的視網(wǎng)膜缺血模型可成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管，可作為今后探究視網(wǎng)膜新生血管疾病治療方法的可靠動物模型。 第三部分、可溶性Flt-1 基因不同片段轉(zhuǎn)移對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的阻遏作用 目的：探究sFlt-1 基因不同片段轉(zhuǎn)移對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的阻遏作用。 方法：建立氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，于小鼠生后第12 天進(jìn)行玻璃體內(nèi)分別注射慢病毒介導(dǎo)的sFlt-1（2-3）和sFlt-1（2-4），于小鼠生后第17

7、 天通過心臟熒光素灌注造影視網(wǎng)膜鋪片和眼球連續(xù)切片蘇木精-伊紅（H-E）染色觀察并比較兩者對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的阻遏作用，并通過Western blot和免疫組織化學(xué)的方法檢測兩者對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和VEGF 受體-2（KDR/Flk-1）表達(dá)的影響。 結(jié)果：通過熒光素灌注造影視網(wǎng)膜鋪片觀察到Lenti.sFlt-1（2-3）和Lenti.sFlt-1(2-4)轉(zhuǎn)移后小鼠視網(wǎng)膜新生血管均顯著減少，眼球連續(xù)切片H

8、-E 染色發(fā)現(xiàn)Lenti.sFlt-1（2-3）轉(zhuǎn)移較Lenti.sFlt-1（2-4）更能有效地減少突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。通過Western blot和免疫組織化學(xué)的方法檢測到視網(wǎng)膜VEGF 表達(dá)無明顯改變，而視網(wǎng)膜KDR/Flk-1的表達(dá)下降較顯著，并且Lenti.sFlt-1（2-3）的作用較Lenti.sFlt-1（2-4）更明顯。 結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)的sFlt-1 基因片段轉(zhuǎn)移能夠明顯阻礙小鼠視網(wǎng)膜VEG