CatSper作為不育病因檢查和避孕靶點的探索性研究.pdf

1、CatSper家族特異性表達于精子，并為雄性生育所必需，這使研究者們認為有兩方面的應(yīng)用前景：作為男性不育病因檢查的切入點和理想的避孕靶點。本論文分兩部分分別對這兩方面作了一些前期的探索性研究。
　　 第一部分
　　 實驗一、
　　 背景與目的：CatSper家族的四個成員被認為是形成異四聚體而行使其功能，但近期對于CatSper家族四個成員表達定位的爭論，及其他能與CatSper結(jié)合的蛋白的發(fā)現(xiàn)，使CatSper

2、家族四個成員的關(guān)系變得復雜和不明確。本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^定量檢測和比較CatSper家族四個成員的mRNA在小鼠睪丸發(fā)育過程中的動態(tài)變化，明確CatSper家族成員在睪丸發(fā)育中的表達模式，為進一步研究CatSper家族成員間的關(guān)系及其功能單位，以及研究和應(yīng)用CatSper提供實驗依據(jù)。
　　 方法：在普通逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈反應(yīng)體系中添加熒光染料SYBR GREEN Ⅰ建立熒光實時RT-PCR體系，以β-Actin作為內(nèi)參，用相對定量法

3、檢測CatSper家族四個成員的mRNA在出生后8，11，15，18，21，25，28，35，42，56和120d齡C57BL/6小鼠睪丸發(fā)育過程中的表達。熒光實時RT-PCR循環(huán)采用四步法，即在靠近擴增產(chǎn)物Tm值前采集熒光，以消除引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的影響。
　　 結(jié)果：CatSper家族四個成員的mRNA在小鼠睪丸發(fā)育中共有三種不同的表達模式，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄啟動及上調(diào)時間點的不同：
　　 1)CatSper1 m

4、RNA在18d齡小鼠睪丸開始表達，在25d、28d齡和42d齡表達明顯上調(diào)，與各自前一時間天齡小鼠睪丸相比，差別有顯著性意義。自42d后上調(diào)緩慢，至成年小鼠時達到最高水平。2)CatSper2 mRNA在8d齡小鼠睪丸就可被檢測到，繼而在18d、35d齡表達明顯上調(diào)，與各自前一時間天齡小鼠睪丸相比，差別有顯著性意義。35d 后水平稍下降，因此，CatSper2 mRNA表達高峰在35d齡。
　　 3)CatSper3和CatSp

5、er4 mRNA在小鼠睪丸發(fā)育過程中的表達啟動及調(diào)節(jié)模式相似：在15d齡小鼠睪丸表達啟動，在21d、25d齡和35d齡表達明顯上調(diào)，與各自前一時間天齡小鼠睪丸相比，差別有顯著性意義，之后表達逐漸上調(diào)，至成年小鼠時達到最高水平。
　　 結(jié)論：CatSper家族四個成員的mRNA在小鼠睪丸發(fā)育中有不同表達模式，為進一步研究CatSper家族成員間的關(guān)系及其功能單位提供實驗依據(jù)，也為研究和應(yīng)用CatSper家族奠定一定基礎(chǔ)。
　

6、　 實驗二、
　　 背景與目的：本實驗的目的是檢測CatSper家族四個成員的mRNA在人成熟精子中存在的情況，并探討人射出精子CatSper家族mRNA水平與精子質(zhì)量的關(guān)系，以及CatSper家族在人精子前向運動中的作用，為CatSper家族作為男性不育病因檢查和研究提供一個新的靶點和途徑。
　　 方法：參照世界衛(wèi)生組織標準選取正常精液標本，為明確CatSper家族mRNA是否存在于人射出精子中，關(guān)鍵是要排除精液中睪

7、丸生精細胞的污染。采用Percoll(80[％]和40[％]兩個濃度)純化精子兩次，顯微鏡下確認純化效果后用于提取RNA。用普通RT-PCR檢測CatSper家族mRNA是否存在于人射出精子中，并同步擴增C-Kit，排除精液中睪丸生精細胞的污染。
　　 為比較高、低活力精子中CatSper家族mRNA水平的差異，正常精液標本用四層密度梯度Percoll(自下而上濃度分別95，76，57和47.5[％])離心分離出高活力和低活力精

8、子。要求低活力精子a+b級精子活力小于30[％]，且高活力精子a+b級精子活力大于90[％]，低活力精子和高活力精子的存活率均大于85[％]。同上排除精液中睪丸生精細胞的污染，提取RNA，以β-Actin作為內(nèi)參，熒光實時RT-PCR(四步法)相對定量法檢測CatSper家族成員的mRNA在高活力和低活力精子中的水平并比較。
　　 結(jié)果：共對5例標本進行了純化，均達到純化標準并用于檢測CatSper家族成員mRNA存在情況。這5

9、例標本均檢測到CatSper2和CatSper3的mRNA存在，而僅在2例標本中檢測到CatSper1 mRNA的存在，這5例純化精子標本中均未檢測到CatSper4 mRNA的存在。
　　 共對12例標本進行了高、低活力精子的分離，有10例達到純化標準及活力、存活率的要求，用于檢測了CatSper家族成員在高、低活力精子中的mRNA水平。CatSper2、3 mRNA的水平在各標本中的變化范圍較大，經(jīng)β-Actin標準化后，各

10、標本間仍有數(shù)倍乃至數(shù)十倍的差異，但仍呈正態(tài)分布。除了有一例標本低活力精子中CatSper3 mRNA的水平略高于高活力精子外(0.88 vs.0.82)，在其他標本中，低活力精子中CatSper2、3 mRNA的水平均低于高活力精子。經(jīng)配對t檢驗，高、低活力精子間，CatSper2、3 mRNA的水平差異有顯著性意義(P<0.01)。高活力和低活力精子的活率差異無顯著性意義(92.6±1.6 vs.91.7±1.7，P=0.228)。<

11、br>　　 結(jié)論：為應(yīng)用人成熟精子CatSper家族mRNA作為不育病因檢查和研究提供實驗依據(jù)和參考，精子中CatSper2和CatSper3 mRNA水平檢測可考慮作為男性不育，尤其是弱精子癥病因檢查的新靶點。但CatSper2和CatSper3 mRNA水平存在較大的個體差異，所以，研究其與不育的關(guān)系可能需要較大的樣本。
　　 第二部分
　　 實驗一、
　　 背景與目的：CatSper1是CatSper家族

12、第一個被發(fā)現(xiàn)的成員。CatSper1在小鼠精子中的表達、定位及在小鼠精子生理功能中的主要作用已基本明確，并被認為是避孕及男性不育研究的理想靶點，但目前尚未見CatSper1在人精子中表達及其功能的報道。本實驗的目的是明確CatSper1在人睪丸、精子中表達及定位，為CatSper1的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：用Western Blot和間接熒光免疫組織化學檢測人睪丸組織和Percoll(80[％]和40[％]兩個濃度)純化

13、人精子中CatSper1蛋白的表達。
　　 結(jié)果：CatSper1蛋白在人睪丸組織及人成熟精子中都有表達，在人睪丸表達于精子細胞，并定位于射出成熟精子尾部的主段。
　　 結(jié)論：CatSper1蛋白在人類睪丸呈減數(shù)分裂后表達方式，與小鼠CatSper1轉(zhuǎn)錄啟動于減數(shù)分裂后的結(jié)果相吻合；CatSper1蛋白在人精子表達的定位也與小鼠相同。這些都提示，CatSper1在人精子中的功能可能與小鼠是相同的。
　　 實驗二、

14、
　　 背景與目的：目前尚未見以CatSper1為靶點進行避孕研究的報道，也沒有特異性的拮抗劑。作為在精子功能及精卵結(jié)合方面起重要作用，且定位于精子膜上的精子特異性抗原，我們推測免疫避孕可能成為可行有效的途徑。離子通道自身免疫性疾病也表明，用針對離子通道的抗體阻斷其功能是有效可行的。本實驗的目的是通過觀察抗CatSper1跨膜區(qū)及胞外段的抗體在體外對人精子功能和小鼠精子體外授精能力的影響，探討CatSper1跨膜區(qū)及胞外段用于免

15、疫避孕的可能性，明確CatSper1用于免疫避孕的主要作用環(huán)節(jié)，也間接研究人精子CatSper1的功能。
　　 方法：間接熒光免疫組織化學方法檢測本實驗所用的抗CatSper1多克隆抗體(所針對抗原為CatSper1的跨膜區(qū)及胞外段)與人、小鼠精子結(jié)合的特異性。按世界衛(wèi)生組織標準選取正常精液標本，經(jīng)SpermRinse上游優(yōu)化，與抗CatSper1
　　 多克隆抗體(終濃度為50 μg/ml)孵育，顯微鏡下觀察抗CatS

16、per1多克隆抗體是否引起精子凝集，計算機輔助精液分析系統(tǒng)檢測抗體對精子活力和超活化運動的影響，考馬斯亮蘭G250染色觀察抗體對頂體反應(yīng)的影響。取BALB/c小鼠附睪尾部精子，在授精前與抗CatSper1多克隆抗體(終濃度為50 μg/ml)孵育90 min，觀察抗體預(yù)處理對精子體外授精能力的影響。
　　 結(jié)果：實驗所用的抗CatSper1多克隆抗體與人和小鼠精子均結(jié)合于精子尾部主段，未發(fā)現(xiàn)非特異性結(jié)合。終濃度為50 μ的g/m

17、l該抗體和精子體外培養(yǎng)：
　　 1)2 h后，顯微鏡下無精子凝集發(fā)生。
　　 2)1 h、2 h、4 h后，活力下降，與對照組相比，差異有顯著性意義(P<0.005)。且活力的降低主要表現(xiàn)為a級精子(快速前向運動精子)減少，與對照組相比，各時間點的差異均有顯著性意義(P<0.01或P<0.005)。
　　 3)4 h后，對精子頂體反應(yīng)無明顯影響(P=0.61)。
　　 4)5 h后，對精子超活化運動有明顯

18、抑制作用(P<0.05)。
　　 BALB/c小鼠精子，在授精前經(jīng)50 μg/ml抗CatSper1多克隆抗體預(yù)處理90 min，受精率為45.8[％](77/168)，與對照組相(80.4[％]，123/153)比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：本實驗首次以精子特異性離子通道為靶點，體外探討了CatSper1用于免疫避孕的可能性和有效性。抗CatSper1跨膜區(qū)及胞外段的抗體通過特異性結(jié)合于精子Ca