急性高血氨攻擊大鼠肝臟增殖與凋亡的初步研究.pdf

1、背景：
　　 肝臟豐富的血液供應(yīng)和獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)使其代謝極為活躍,在我們生命活動(dòng)中起著舉足輕重的作用。血氨(blood ammonia,BA)主要來(lái)源于腸道產(chǎn)氨、腎臟泌氨、肌肉產(chǎn)氨等,是正常體內(nèi)代謝產(chǎn)物。氨對(duì)人體的毒性很大,機(jī)體不惜消耗巨大能量,及時(shí)將氨轉(zhuǎn)變成無(wú)毒或毒性小的物質(zhì)排出體外,清除多余的氨來(lái)保持體內(nèi)含量穩(wěn)定。肝臟是氨的主要代謝場(chǎng)所。
　　 肝衰竭(hepatic failure,HF)是臨床常見(jiàn)的危急重癥之一,

2、其死亡率高達(dá)70％～80%,多數(shù)患者死于多種并發(fā)癥,包括肝性腦病、肝腎綜合癥、出血等。研究其原因在于肝衰竭后,大量的肝細(xì)胞壞死和凋亡,肝細(xì)胞功能受損,“殘存”肝細(xì)胞不能滿足身體需要而產(chǎn)生一系列功能紊亂,包括血氨升高,乳酸中毒,血糖紊亂,吲哚水平增高等,其中以血氨升高最為引人注目。在臨床治療中我們發(fā)現(xiàn),在以“二次打擊學(xué)說(shuō)”為底線,相同的抗病毒、維護(hù)肝功能等基礎(chǔ)治上,全程門冬氨酸鳥氨酸治療可能延緩乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭的進(jìn)展,通過(guò)降

3、低血氨水平可顯著緩解肝臟損傷,有效促進(jìn)肝細(xì)胞的解毒、分泌、合成及轉(zhuǎn)化功能,降低病死率,改善患者預(yù)后。在病毒和內(nèi)毒素二次打擊的基礎(chǔ)上,血氨等毒性物質(zhì)在體內(nèi)聚集,是否對(duì)肝衰竭后“殘存”的肝細(xì)胞功能造成影響,目前尚不清楚。
　　 研究顯示血氨升高對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞具有毒性作用。當(dāng)肝臟嚴(yán)重?fù)p傷時(shí),肝細(xì)胞數(shù)量減少,必然導(dǎo)致體內(nèi)代謝廢物增加,血氨濃度增加,對(duì)腦神經(jīng)組織損害最明顯。肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)是嚴(yán)

4、重肝病引起的、以代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)的綜合病征,其中以氨中毒學(xué)說(shuō)的研究最多。血氨在腦中主要通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酰胺合成酶完成代謝,星形膠質(zhì)細(xì)胞是氨神經(jīng)毒性的主要靶細(xì)胞,氨可以通過(guò)引起能量代謝、氧化應(yīng)激、線粒體通透性轉(zhuǎn)換、GABA和GLU神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及水通道蛋白4(AQP4)表達(dá)的改變、增加腦水腫、改變基因表達(dá)等,最終導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)支持作用降低,引發(fā)肝性腦病。
　　 然而血氨升高

5、并不是對(duì)所有機(jī)體細(xì)胞都有毒性,研究顯示氨對(duì)于不同來(lái)源細(xì)胞的生長(zhǎng)影響可以明顯不同:在相同濃度的血氨作用下,293、HDF、Vero和PQXB1/2細(xì)胞系較少受到生長(zhǎng)抑制或者不受到生長(zhǎng)抑制,而McCoy、MDCK細(xì)胞系較多細(xì)胞受到生長(zhǎng)抑制,但HeLa、BHK細(xì)胞系生長(zhǎng)存在明顯的生長(zhǎng)抑制,血氨對(duì)細(xì)胞的影響具有明顯細(xì)胞特異性。
　　 通過(guò)探索我們采用特定的氯化銨溶液給大鼠特定時(shí)間的灌胃刺激,可造成健康大鼠血氨明顯升高,構(gòu)建了急性高血氨模

6、型。本文從細(xì)胞增殖周期及凋亡的角度,應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法觀察CyclinD1、CyclinA在高血氨組和對(duì)照組的表達(dá)和定位,并采用TUNEL,法觀察兩組肝臟組織凋亡情況,對(duì)急性高血氨攻擊后大鼠肝臟的變化進(jìn)行初步研究,探索血氨升高對(duì)肝臟細(xì)胞的影響。
　　 目的：
　　 通過(guò)構(gòu)建急性高血氨大鼠模型,初步探索血氨對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞的影響,為肝衰竭可能的發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù),進(jìn)一步為肝衰竭的治療提供新的途徑和靶點(diǎn)。
　

7、　 方法：
　　 1.模型構(gòu)建:雄性SD大鼠24只,體重200g±25g,隨機(jī)分為2組:高血氨組給予健康大鼠10%氯化銨溶液-10ml/kg體重灌胃,每天給藥兩次,間隔8h,連續(xù)30天。對(duì)照組給予健康大鼠生理鹽水10m/kg體重灌胃,每天給藥兩次,間隔8h,連續(xù)30天。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法:30天后采用心臟采血的方式收集高血氨組和對(duì)照組大鼠的血液標(biāo)本,立即檢測(cè)血氨(BA)及丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(

8、AST)、直接膽紅素(DBil),同時(shí)取肝臟活組織標(biāo)本制作蠟塊,進(jìn)行蘇木素-伊紅HE染色,應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)CyclinD1、CyclinA在大鼠肝臟的表達(dá),并采用TUNEL法對(duì)大鼠肝臟的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。高血氨組和對(duì)照組兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),并對(duì)凋亡指數(shù)AI和CyclinD1、CyclinA的平均

9、積分光密度值IOD進(jìn)行Spearman秩相關(guān)性分析(以Spearman相關(guān)系數(shù)r表示相關(guān)強(qiáng)度)。P值雙側(cè),α=0.05,當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R＞0為正相關(guān),r＜0為負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)照組及高血氨組大鼠給藥后一般狀況良好,無(wú)明顯氨中毒癥狀,存活率為100%。
　　 2.血氨BA水平比較:高血氨組在給予氨負(fù)荷后出現(xiàn)血氨升高,與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P=0.001(P＜0.01

10、)。
　　 3.肝功能ALT、AST、DBil比較:ALT、AST、DBil水平在高血氨組與對(duì)照組相比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 4.大鼠肝臟病理HE染色:對(duì)照組病理均為正常的肝臟病理結(jié)果。高血氨組大鼠部分(58.33%)肝臟結(jié)構(gòu)基本正常,部分(41.67%)可見(jiàn)輕度的細(xì)胞水腫改變,未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死。
　　 5.大鼠肝臟增殖情況:(1)CyclinA表達(dá)在高血氨組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義,P=0.001.(P＜0.01)。(2)CyclinD1表達(dá)在高血氨組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P=0.024(P＜0.05)。
　　 6.大鼠肝臟凋亡情況:高血氨組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)AI為5.84±2.25%,與對(duì)照組凋亡指數(shù)AI1.45±0.68%比較,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P=0.003(P＜0.01)。
　　 7.大鼠肝臟細(xì)胞增殖與凋亡的相關(guān)性分析:(1)對(duì)照組大鼠肝臟AI與CyclinAIOD無(wú)

12、相關(guān)性(r=0.576,P=0.082);高血氨組大鼠肝臟AI與CyclinAIOD無(wú)相關(guān)性(r=-0.321,P=0.365)。(2)對(duì)照組大鼠肝臟AI與CyclinD1IOD無(wú)相關(guān)性(r=-0.250,P=0.486);高血氨組大鼠肝臟AI與CyclinD1IOD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.697,P=0.025)。
　　 結(jié)論：
　　 1.給予健康大鼠10%氯化銨溶液-10ml/kg體重灌胃,每天給藥兩次,間隔8h,連續(xù)3

13、0天,可成功構(gòu)建急性高血氨大鼠模型。
　　 2.急性高血氨攻擊可以引起肝功能明顯異常,誘導(dǎo)肝損傷。
　　 3.急性高血氨攻擊可以引起部分大鼠肝臟細(xì)胞輕度水腫改變,未見(jiàn)炎癥細(xì)胞明顯浸潤(rùn),其中以細(xì)胞凋亡為主要表現(xiàn)形式。
　　 4.急性高血氨攻擊后大鼠肝臟CyclinA和CyclinD1的表達(dá)增加,可能影響肝臟細(xì)胞增殖周期。
　　 5.急性高血氨攻擊下,大鼠肝臟細(xì)胞凋亡數(shù)量增多,而且CyclinD1的表達(dá)與凋亡