人類皰疹病毒8型（HHV-8）在廣州地區(qū)獻(xiàn)血人群中的感染情況調(diào)查及K13基因的原核表達(dá)體系的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的:人類皰疹病毒8型(humanherpesvirus8，HHV-8)，又稱卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV)，是Chang等于1994年在一例艾滋病患者的卡波氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma，KS)組織中用代表性差異分析方法(representativedifferenceassay)發(fā)現(xiàn)并鑒定的一種新型皰疹病毒。隨后的研究發(fā)現(xiàn)HHV-8存在

2、于所有類型的KS組織中(包括經(jīng)典型、艾滋病相關(guān)型、地方型和醫(yī)源型KS)，并認(rèn)為是KS發(fā)生的條件之一。HHV-8還與原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primaryeffusionlymphoma，PEL)，多中心性卡斯特萊曼病(multicentricCastleman'sdisease，MCD)的發(fā)病密切相關(guān)。 HHV-8的感染率在不同的地區(qū)及用不同的血清學(xué)方法所檢測(cè)的結(jié)果不盡相同。由于缺乏血清學(xué)診斷的“金”標(biāo)準(zhǔn)，所得的結(jié)果不一定都能反映真

3、實(shí)情況，但基本上都反映了相似的趨勢(shì)，即與KS的發(fā)病率存在平行關(guān)系。目前我國(guó)尚無(wú)大規(guī)模普通人群，特別是無(wú)償獻(xiàn)血人群的HHV-8感染率的報(bào)道。本研究首次對(duì)廣州地區(qū)3135名無(wú)償獻(xiàn)血者進(jìn)行了血清流行病學(xué)調(diào)查，并用巢式PCR法對(duì)廣州地區(qū)500名無(wú)償獻(xiàn)血者進(jìn)行了外周血單核細(xì)胞中HHV-8DNA的檢測(cè)。 HHV-8基因組為線性雙鏈DNA，有一長(zhǎng)約140.5kb的獨(dú)特編碼區(qū)(uniquecodingregion)，編碼至少85個(gè)開(kāi)放讀碼框架(

4、openreadingframes，ORFs)，包括15個(gè)為HHV-8特有的ORFs，K13即為其中之一。 盡管做了大量的研究，目前仍未建立標(biāo)準(zhǔn)的HHV-8血清學(xué)診斷方法，主要的原因之一是對(duì)哪些病毒蛋白可作為抗原用于檢測(cè)還未完全了解。HHV-8在普通健康人群中存在一定的感染率，而且病毒通常以潛伏感染狀態(tài)長(zhǎng)期存在于人體。對(duì)病毒潛伏感染的檢測(cè)在調(diào)查普通人群感染率時(shí)顯得尤為重要，且同時(shí)使用潛伏期和裂解期蛋白檢測(cè)血清中的抗體可以提高檢測(cè)

5、的敏感性。K13基因編碼的vFLIP(viralFas-associateddeathdomainIL-β-convertingenzyme(FLICE)inhibitoryprotein)蛋白是病毒主要潛伏期蛋白之一，體外克隆和表達(dá)潛伏基因是建立HHV-8潛伏感染檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。本研究構(gòu)建了pGEX-4T-1/K13重組質(zhì)粒大腸桿菌表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的體外表達(dá)，并對(duì)目的蛋白的抗原性進(jìn)行分析。 材料和方法:1.3135份血漿

6、及500份全血來(lái)自2004年10月至2005年3月在廣州市參加無(wú)償獻(xiàn)血的人群，均經(jīng)過(guò)金標(biāo)HBsAg快速試紙條初篩合格。 2.HHV-8IgGELISAKit(ABI，USA)檢測(cè)3135份血漿抗HHV-8IgG抗體。 3.500份全血基因組DNA抽提用TaKaRaMiniBESTBlood&CulturedCellGenomicDNAExtractionKitVer.2.0試劑盒抽提基因組DNA。 4.巢式PCR

7、擴(kuò)增以KS4/KS5為外對(duì)引物，KSl/KS2為內(nèi)對(duì)引物做巢式PCR，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。 5.K13蛋白的原核表達(dá)及抗原性分析將質(zhì)粒pGEX-4T-l和HHV-8K13基因分別用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，純化連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-l/K13。重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/K13經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，以異丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)融和蛋白，對(duì)表達(dá)的融合

8、蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western-Blot分析。 結(jié)果:1.3135名獻(xiàn)血者中有6名在血漿標(biāo)本中檢測(cè)出HHV-8IgG抗體陽(yáng)性，均為漢族、男性獻(xiàn)血員，總陽(yáng)性率為0.19％。 2.500名獻(xiàn)血者中有2名在外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)出HHV-8DNA，均為漢族、男性獻(xiàn)血員，總陽(yáng)性率為0.4％。 3.構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/K13，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的體外表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示目的蛋白條帶分子量約為47

9、kDa，與理論值相符。Western-Blot分析表明目的蛋白不能被HHV-8IgG抗體陽(yáng)性的血漿識(shí)別。 結(jié)論:1.廣州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者HHV-8的感染率較低，而且目前對(duì)HHV-8的致病性、傳播方式等方面了解還不全面，標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法尚未建立，故目前無(wú)需對(duì)廣州地區(qū)獻(xiàn)血者進(jìn)行HHV-8的檢測(cè)。 2.構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/K13，成功地在體外表達(dá)了重組融合蛋白，Western-Blot證實(shí)重組融合蛋白不能被HHV-8