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文檔簡介
1、目的:應用鹽酸利多卡因致大鼠中毒驚厥模型,測定中毒驚厥過程中海馬CA1區(qū)細胞外液谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)含量,并應用N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)拮抗劑MK-801,觀察的NMDAR1活性以及Glu和GABA含量的變化,探討MK-801在利多卡因致大鼠中毒驚厥過程中的作用機制。 方法: 1.實驗分組及動物模型的制備 22只Wistar雄性大鼠,體重250±20 g(河北醫(yī)科大學實驗動
2、物中心提供)。隨機分為3組,對照組(C組,6只)、利多卡因組(L組,8只)、MK-801+利多卡因組(MK-801+L組,8只)。大鼠異氟烷(isoflurane)麻醉后氣管插管,手術過程中持續(xù)吸入3%異氟烷維持麻醉,右股靜脈切開置管以1ml/h的速度輸入乳酸鈉林格氏液。刺入電極持續(xù)監(jiān)測心電圖(ECG)和腦電圖(EEG)。用微型顱鉆在左側(cè)海馬CA1區(qū)(前囟[bregma]后方3.6mm和中線左旁開2mm處)打開一直徑約2mm的圓孔,小心
3、挑開硬腦膜,將微透析針垂直刺入大腦皮層2mm,以2μl/min的速度持續(xù)輸注乳酸鈉林格氏液。手術操作完成后,持續(xù)吸入1.5%異氟烷維持麻醉。微透析針置入60 min后開始收集腦組織微透析液,每隔10min收集一次,首先收集20 min,之后按照實驗分組給與不同的處理。 (1)C組:腹腔注射生理鹽水0.5 mg/kg,30 min后繼續(xù)收集透析液40 min,于-20℃冰箱內(nèi)保存待測。 (2)L組:腹腔注射生理鹽水0.5
4、mg/kg,30 min后2%利多卡因2mg靜注,然后以4 mg·kg-1·min-1的速度經(jīng)股靜脈持續(xù)泵入,C組以相同速度靜注或泵入乳酸鈉林格氏液。觀察驚厥波(EEG上出現(xiàn)振幅超過100 μV寬大快速的棘波并持續(xù)10 s以上)出現(xiàn)后,停止泵入利多卡因,其他兩組泵入利多卡因或乳酸鈉林格氏液時間與所求得的預試驗中L組輸入利多卡因時間的95%可信區(qū)間相當,記錄驚厥波發(fā)生及持續(xù)時間,呼吸抑制及持續(xù)時間,余操作與C組相同。 (3)MK-
5、801+L組:靜脈泵入利多卡因前30 min腹腔注射MK-801 0.5 mg/kg,余操作與L組相同。各組分別在微透析針置入60分鐘及L組開始出現(xiàn)驚厥波時(其他兩組于相應時間點)兩個時間點采集股動脈血測動脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2),呼吸抑制期間給與輔助呼吸,以維持PaO2和PaCO2在正常范圍。 2.標本的采集及檢測方法 2.1 NMDAR1表達的檢測實驗進行2.5小時后,大鼠深麻醉下經(jīng)心臟用0
6、.9%生理鹽水和4%多聚甲醛溶液各50 ml灌流固定,完整取出腦組織,冠狀切取前囟部位3~13mm的組織,浸入4%多聚甲醛溶液中保存?zhèn)溆?。之后酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋,連續(xù)冠狀切片(片厚5 μm),用抗NMDAR1多克隆抗體進行免疫組化染色(ABE法)。在右側(cè)海馬CA1區(qū)相同部位分別取4個相鄰的40倍視野,以胞漿或胞核染成棕黃色作為陽性細胞,計陽性細胞數(shù),計算出平均數(shù)和標準差,數(shù)據(jù)以(-x)±s表示,采用SPSS 11.5軟件進
7、行方差分析及t檢驗,P<0.05表示差異有顯著性。 2.2 海馬CA1區(qū)谷氨酸和GABA濃度的檢測利用柱前衍生高效液相色譜-熒光法測定出各種濃度的谷氨酸和GABA標準品的峰面積,并繪制標準曲線、求得回歸方程。利用該方法測出每個樣品中上述兩種氨基酸的峰面積,根據(jù)回歸方程求得氨基酸的濃度。 結果: 1.各組間體重、心率、微透析針置入并穩(wěn)定60 min及L組開始出現(xiàn)驚厥波時(其他兩組于相應時間點)兩個時間點動脈血氣指標
8、比較差異無統(tǒng)計學意義。 2.各組間驚厥波出現(xiàn)時間、呼吸抑制出現(xiàn)時間及持續(xù)時間的比較C組未見驚厥波,后兩組均見驚厥波出現(xiàn),其中L組每只均見驚厥波,而MK-801組只有兩只出現(xiàn)了驚厥波。與L組比較,MK-801+L組呼吸抑制出現(xiàn)較晚,呼吸抑制持續(xù)時間較短。 3.各組間海馬CA1區(qū)NMDAR1表達的比較與C組比較,L組、MK-801+L組NMDAR1免疫陽性細胞數(shù)均顯著增多;與L組比較,MK-801+L組NMDAR1免疫陽性細
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