百日草鏈格孢菌毒素的生產(chǎn)、分離、純化和鑒定及其作為微生物源除草劑潛力的研究.pdf

1、百日草鏈格孢菌(Alternariazinniae)是世界惡性雜草蒼耳(Xanthiumsibiricum)的自然致病菌，其產(chǎn)生的除草活性物(毒素)對蒼耳(Xanthiumsibiricum)、紫莖澤蘭(Eupatoxiunadenophorum)、加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis)、小飛蓬(Conyzacanadensis)等菊科雜草及其它農(nóng)田、園林和草坪雜草具有致病活性。本文以該菌為研究對象探索了該致病毒素的深層

2、發(fā)酵培養(yǎng)條件、大批量生產(chǎn)、化學(xué)提取工藝、致病機(jī)理，并對其作為微生物源除草劑的開發(fā)應(yīng)用潛力進(jìn)行了評價；通過現(xiàn)代有機(jī)分析技術(shù)提取純化出了百日草鏈格孢菌毒素的化合物單體并確定了該毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 研究了不同碳源、氮源以及環(huán)境培養(yǎng)條件對百日草鏈格孢菌液體深層培養(yǎng)的影響。應(yīng)用正交試驗(yàn)確定了碳源、氮源最優(yōu)水平組合為A4B3D4E1；確定了有利于該菌產(chǎn)毒的溫度為25℃、pH值為6.5、培養(yǎng)時間為9～12天、以及黑暗與光照、溶氧、轉(zhuǎn)速、體積等培

3、養(yǎng)條件并對培養(yǎng)基進(jìn)行了改良；流加C、N源可以在優(yōu)化發(fā)酵促進(jìn)產(chǎn)毒的同時降低原料用量。并利用20L自動發(fā)酵罐對放大深層發(fā)酵實(shí)踐進(jìn)行了初步探索。 利用直接萃取法、大孔吸附樹脂濃縮提取法、大孔吸附樹脂濃縮+有機(jī)溶劑萃取法等3種方法，并以石油醚、1,2-二氯乙烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等6種極性不同的溶劑提取百日草鏈格孢菌粗毒素，研究結(jié)果表明，大孔吸附樹脂濃縮+有機(jī)溶劑萃取法較理想，正丁醇提取效率最高，其毒素回收率可達(dá)89.7％；采

4、取大孔吸附樹脂吸附濃縮、乙醇洗脫、減壓蒸餾去乙醇、乙酸乙酯萃取常壓濃縮的工藝流程可達(dá)到對液體培養(yǎng)無菌濾液中百日草鏈格孢菌毒素的有效提取和初步分離。該工藝流程效率高、節(jié)約能源與時間、克服了常規(guī)濃縮方法的缺點(diǎn)、濃縮體積下的常壓蒸餾節(jié)約了工藝操作時間，在溶劑可回收利用、浪費(fèi)少、毒素提取效率等方面的優(yōu)點(diǎn)顯示了它的生產(chǎn)可操作性和極高的生產(chǎn)利用價值。 對菌絲和培養(yǎng)液進(jìn)行萃取，結(jié)果表明，百日草鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素是分泌于培養(yǎng)液中的，屬于胞外毒素

5、；通過分析貯存時間、溫度、光照對粗毒素穩(wěn)定性的影響，表明貯存時間、溫度、光照對毒素穩(wěn)定性影響很小，具有開發(fā)微生物源化學(xué)除草劑之潛力。 利用三次經(jīng)典硅膠柱層析和HPLC、兩步TLC多次制備得到對紫莖澤蘭有致病性的毒素單體。百日草鏈格孢菌毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定按照常規(guī)有機(jī)化合物鑒定方法進(jìn)行。首先利用快原子轟擊法(FAB)測得到了有關(guān)分子量的初步信息為561(M+1)，再利用X-射線衍射法進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)信息的進(jìn)一步精確分析，得到該物質(zhì)的晶體結(jié)

6、構(gòu)的信息并將其與軟件結(jié)合得到直觀的分子結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)與質(zhì)譜有差別，因此再次進(jìn)行了質(zhì)譜分析，著重低分子量區(qū)域的掃描結(jié)果得到分子量的信息為281(M+1)，最后利用核磁與紅外獲取該物質(zhì)的特征譜圖信息，該毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行最終確定為二環(huán)內(nèi)酯的Brefeldin(BFA)。 研究了百日草鏈格孢菌毒素對紫莖澤蘭、加拿大一枝黃花的作用機(jī)理。百日草鏈格孢菌毒素使紫莖澤蘭與加拿大一枝黃花葉組織細(xì)胞膜透性上升，膜脂過氧化加強(qiáng)，抗氧化酶活性增加。同時

7、，對毒素的光合生理影響做了研究，初步揭示出毒素對于兩種入侵植物的光合機(jī)理 選擇51種植物，以離體葉片針刺法對粗毒素的致病范圍進(jìn)行了測試，表明粗毒素具有一定范圍的選擇作用特性，其中馬唐、石龍芮、天胡荽、蠶豆、波斯婆婆納、野芝麻、黃鵪菜、柔弱斑種草等植物對毒素敏感。 篩選出一可用于莖葉處理的粗毒素助劑配方，各種助劑的濃度在皆為1‰的條件下對同為菊科雜草的小飛蓬的致病力在稀釋8倍到16倍時病害程度達(dá)4級以上，能夠達(dá)到明顯的株防