葡萄糖調(diào)控新基因GMRP-1與NCEx的表達及初步功能研究.pdf

1、第一部分 人糖代謝相關(guān)蛋白一1的蛋白表達與功能的初步研究 目的:克隆和表達人糖代謝相關(guān)蛋白-1(GMRP-1)基因，初步揭示GMRP-1的功能。方法:RT-PCR克隆GMRP-1基因全長，將GMRP．1基因構(gòu)建到原核表達載體pET-32a與真核表達載體pEGFP-C3，在EcolROSSET(DE3)菌中高效表達并純化GMRP-1融合蛋白，免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體；利用共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在HEK293細胞中

2、的定位。利用NorthernBlot與WesternBlot技術(shù)觀察了GMRP-1基因和蛋白表達譜，利用雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在胰腺中的定位。同時利用NorthernBlot與WesternBlot技術(shù)觀察不同濃度葡萄糖不同作用時間對β-TC3細胞GMRP．1的基因和蛋白表達的影響。通過轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)觀察GMRP-1與β-TC3細胞胰島素分泌的關(guān)系。結(jié)果:成功制備特異性好、效價較高的多克隆抗體。激光

3、共聚焦顯微鏡顯示GMRP-1定位于HEK293細胞的細胞漿中。GMRP-1表達廣泛，其中在腦、骨骼肌、脂肪、肝臟、主動脈、十二指腸及β細胞株β-TC3中表達較高。雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡顯示GMRP一1定位在胰島中，在胰腺的外分泌腺中沒有表達，同時GMRP一1與胰島素有部分的重疊。葡萄糖對β-TC3細胞GMRP-1表達的影響呈劑量和時間依賴性關(guān)系，葡萄糖濃度增加，GMRP-1表達增加，20mmol／L濃度下表達最高。葡萄糖

4、作用時間增加，GMRP．1表達增加，72小時表達最高。B-TC3細胞過表達GMRP．1及RNA干擾技術(shù)沉默B-TC3細胞GMRP-1表達后，胰島素分泌沒有明顯的差異。結(jié)論:GMRP-1特異性定位于大鼠胰島中，葡萄糖可以調(diào)控它在胰島β細胞中的表達，它在高糖導(dǎo)致的胰島B細胞功能變化中發(fā)揮重要的作用，它與β細胞胰島素分泌之間沒有直接的關(guān)系。 第二部分 人新型鈉鈣交換蛋白NCEx的蛋白表達與功能的初步研究 目的:克隆

5、和表達人新型鈉鈣交換蛋白NCEx基因，初步揭示NCEx與糖尿病大血管并發(fā)癥的關(guān)系。方法:RT-PCR克隆NCEX基因全長；將NCEX基因構(gòu)建到綠色熒光真核表達載體pEGFP-C3，利用共聚焦顯微鏡觀察NCEX在HEK293細胞與小鼠胰島素瘤β-TC3細胞中的定位。熒光分光光度儀觀察細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。Western印跡檢測NCEx在高血糖猴各組織與2型糖尿病主動脈組織NCEX蛋白的差異表達，RT-PCR檢測NCEX基因在人主動脈平滑肌

6、細胞(HASMC)、人主動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)和人血管巨噬細胞(THP-1)細胞中的表達及不同葡萄糖濃度對其基因表達的影響，Northernblotting雜交驗證高糖作用HAEC細胞NCEXmRNA的表達差異。結(jié)果:重組載體pGFP-C3一NCEX轉(zhuǎn)染后，定位于HEK293細胞與B．TC3細胞的細胞膜上。熒光分光光度儀觀察到NCEx過表達后HEK293細胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常對照組，并有顯著統(tǒng)計學差異。當細胞外145mmo

7、l／L的Na+完全由145mmol／L的Li+置換后，NCEx過表達的HEK293細胞內(nèi)Ca2+濃度出現(xiàn)大幅度的升高，在測定過程中加入終濃度為5mmol／LKCl時，對細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化沒有影響。同時發(fā)現(xiàn)NCEx蛋白在高血糖猴與糖尿病患者主動脈中表達上調(diào)，而在其他組織中無差異表達。同時發(fā)現(xiàn)NCEx主要表達在HAEC中，而HASMC和THP一1表達量低，RT—PCR和NorthernBlotting結(jié)果顯示NCEx基因在血管內(nèi)皮細