中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA編碼的βC1蛋白的磷酸化對其抑制轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的影響.pdf

1、中國番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是單組份的雙生病毒，其伴隨的衛(wèi)星DNA(Tomatoyellow leaf curl China Betasatellite，TYLCCNB)編碼的βC1蛋白是一個(gè)致病因子和RNA沉默抑制子，不僅能夠誘導(dǎo)嚴(yán)重的病毒癥狀而且能夠抑制甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(Transcriptional gene silencing，TGS)。

2、為了抵御雙生病毒的侵染，番茄中具有激酶活性的SlSnRK1[Snf(sucrose non-fermenting)-1-relatedprotein kinases1]蛋白可以通過磷酸化βC1從而減輕病毒誘導(dǎo)的癥狀。但是，目前尚不清楚βC1的磷酸化如何進(jìn)一步影響其相關(guān)功能。因此，本文圍繞βC1蛋白的磷酸化修飾對其抑制TGS能力的影響開展了相關(guān)研究。
　　前期的研究表明，將βC1蛋白兩個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)—第33位的絲氨酸(Serin

3、e，Ser)和78位的蘇氨酸(Threonine，Thr)，分別或者同時(shí)突變?yōu)榻M成型磷酸化的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)，突變體的侵染性克隆在本氏煙上的發(fā)病時(shí)間延遲，侵染效率下降;而將Ser33和Thr78分別或者同時(shí)突變?yōu)椴荒鼙涣姿峄谋彼?Alanine，Ala)后，突變體侵染性克隆在本氏煙上的發(fā)病時(shí)間和侵染效率與野生型βC1的侵染性克隆相似。
　　為了明確βC1磷酸化是否影響βC1蛋白的表達(dá)水平，首先將構(gòu)

4、建于馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)表達(dá)載體上的6個(gè)βC1磷酸化突變體pGR106-βC1S33A、pGR106-βC1S33D、 pGR106-βC1T78A、 pGR106-βC1T78D、 pGR106-βC1S33A/T78A和pGR106-βC1S33D/T78D分別接種本氏煙，以βC1的單克隆抗體進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)βC1突變后其蛋白表達(dá)量無明顯差異。進(jìn)一步將PVX相關(guān)重組載體接種GFP

5、轉(zhuǎn)錄水平沉默的16-TGS本氏煙，發(fā)現(xiàn)βC1的非組成型磷酸化突變體pGR106-βC1S33A、pGR106-βC1T78A和pGR106-βC1S33A/T78A與野生型pGR106-βC1一樣可以回復(fù)GFP熒光，但是其組成型磷酸化的突變體pGR106-βC1S33D、pGR106-βC1T78D和pGR106-βC1S33D/T78D不能回復(fù)GFP熒光，表明βC1的組成型磷酸化突變體不能抑制GFP的轉(zhuǎn)錄水平基因沉默。
　　利用

6、Chop-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，βC1非組成型磷酸化突變體侵染性克隆TYLCCNBS33A、TYLCCNBT78A和TYLCCNBS33A/T78A與野生型TYLCCNB一樣可以降低其輔助病毒TYLCCNV基因組的甲基化水平，但是βC1組成型磷酸化突變體的侵染性克隆TYLCCNBS33D、TYLCCNBT78D和TYLCCNBS33D/T78D不能降低輔助病毒TYLCCNV基因組的甲基化水平，表明βC1的組成型磷酸化突變體減弱了其抑制輔助病毒