基于遺傳轉化手段防治番茄黃化曲葉病毒的研究

1、 I摘要 摘要番茄黃化曲葉病(Tomato yellow leaf Curl Disease，TYLCD)是由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf Curl Virus，TYLCV)引起的、嚴重危害番茄生產(chǎn)的一種雙生病毒病。 目前防治 TYLCV的危害主要策略是防控煙粉虱和選育抗 TYLCV番茄品種等措施， 因此研究植物抗蟲性和抗病性的分子機制對培育抗病性番茄十分重要。本研究利用遺傳轉化的手段，將煙粉虱參

2、與殺蟲劑解毒代謝的細胞色素 P450 基因 CYP6CM1 和羧酸酯酶基因 Coe1 構建 RNAi 載體轉化煙草、番茄抗 TYLCV 相關基因 slIAA4 轉化番茄，研究通過轉基因途徑實現(xiàn)抗煙粉虱和抗 TYLCV 的可能性。煙粉虱的抗藥性與其體內(nèi)解毒酶的解毒代謝作用增強密切相關，細胞色素 P450酶系和羧酸酯酶系是煙粉虱體內(nèi)的重要解毒酶系。 根據(jù) Q 型煙粉虱的一個 P450 基因( CYP6CM1 基因)和一個羧酸酯酶基因 （co

3、e1 基因） 的特異區(qū)域構建雙價 RNAi 載體，農(nóng)桿菌介導法轉化煙草，PCR 檢測獲得 5 株獨立的轉基因株系；選取卡那霉素抗性較好的 T1 代轉基因株系 H1 和 H2 飼喂煙粉虱 5d 后， 熒光定量 PCR 檢測煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1 和 coe1 基因的表達水平， 發(fā)現(xiàn)取食轉基因煙草煙粉虱的 CYP6CM1 基因和coe1 基因表達量僅為取食非轉基因煙草煙粉虱的 18%-24%和 17%-33%。通過瓊脂保濕浸葉法和單株活體

4、法進一步研究煙粉虱取食轉基因煙草后對殺蟲劑的敏感性， 發(fā)現(xiàn)接觸 1g·L-1 阿維·吡蟲啉 72h 后，取食轉基因煙草的煙粉虱死亡率分別比取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率顯著升高 14.77%-16.46%和 16.01%-18.51%；同樣，接觸稀釋1000 倍的 40%（v/v）辛硫磷 72h 后，煙粉虱死亡率顯著升高 22.94%-23.58%和17.4%-18.76%。以上結果表明，轉 CYP6CM1-coe1

5、 RNAi 基因煙草可以顯著抑制取食煙粉虱體內(nèi) CYP6CM1 基因和 coe1 基因的表達水平，降低煙粉虱對煙堿類殺蟲劑阿維·吡蟲啉和有機磷類殺蟲劑辛硫磷的抗藥性，顯著提高了殺蟲劑防治效果，進而提高對煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒的防治效果。植物與侵染植物的病原微生物互作可改變植物體內(nèi)生長素的合成， 而植物生長素含量的改變會通過系列基因的表達變化調(diào)節(jié)植株的生理反應和生長發(fā)育。本研究對TYLCV 脅迫下的含 Ty-3 抗性基因番

6、茄品種和感病番茄品種 9210 的轉錄組學差異進行分析，發(fā)現(xiàn)生長素信號傳導參與了 TYLCV 與番茄的互作過程，其中一個屬于Aux/IAA 生長素原初反應基因家族的 slIAA4 基因表達差異明顯。通過 RT-PCR 克隆了抗性番茄的 slIAA4 基因，qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn) slIAA4 基因在番茄的根、莖、葉、花中都有較高水平的表達，并能響應 TYLCV 的侵染，在煙粉虱接種 TYLCV 0d、3d、5d、7d 時，slIAA4