中國(guó)番茄黃曲葉病毒抵御RNA沉默的機(jī)制和番茄黃曲葉病毒的分子變異研究.pdf

1、雙生病毒是世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的一類單鏈環(huán)狀DNA病毒,已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的作物上造成毀滅性災(zāi)害。為了更好地了解雙生病毒的致病機(jī)理及病毒的危害流行,本論文圍繞雙生病毒抵御RNA沉默的機(jī)制以及雙生病毒的分子變異開展了以下研究:
　　 1中國(guó)番茄黃曲葉病毒及其伴隨的衛(wèi)星DNA來(lái)源的小干擾RNA的鑒定
　　 利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定了中國(guó)番茄黃曲葉病毒(TYLCCNV)及其伴隨的衛(wèi)星betasatellite(TYLC

2、CNB)來(lái)源的小RNA(Small RNA,sRNA)(V-sRNA和S-sRNA)的產(chǎn)生情況。在侵染的番茄和本氏煙中,既能檢測(cè)到正義鏈來(lái)源的V-sRNA和S-sRNA,又能檢測(cè)到負(fù)義鏈來(lái)源的V-sRNA和S-sRNA,而且V-sRNA和S-sRNA的大小以22-nt、21-nt和24-nt為主.將V-sRNA和S-sRNA匹配到TYLCCNV和TYLCCNB的基因組上發(fā)現(xiàn)V-sRNA和S-sRNA的分布是不均勻的,在TYLCCNV單獨(dú)

3、侵染的番茄和本氏煙以及TYLCCNV和TYLCCNB突變體共同接種的本氏煙中,AV2和AVl的5’末端是V-sRNA產(chǎn)生的熱點(diǎn)區(qū),而在TYLCCNV和TYLCCNB共同侵染的番茄和本氏煙中,該區(qū)域所產(chǎn)生的V-sRNA受到抑制,不再是V-sRNA所產(chǎn)生的熱點(diǎn)區(qū),取而代之的是,AC2和AC3的重疊區(qū)以及ACl的3'末端成為V-sRNA產(chǎn)生的熱點(diǎn)區(qū),表明TYLCCNB編碼的βCl蛋白在TYLCCNB改變V-sRNA在TYLCCNV基因組上的分

4、布中發(fā)揮了重要作用。對(duì)TYLCCNB而言,βCl作為癥狀決定因子,不管是否發(fā)生突變,均是S-sRNA產(chǎn)生的熱點(diǎn)區(qū)。對(duì)病毒各個(gè)ORF的轉(zhuǎn)錄本含量進(jìn)行分析表明冗余的病毒轉(zhuǎn)錄本有可能被植物的RNA依賴的RNA聚合酶(RDR)識(shí)別并且作為RDR合成dsRNA的模板,誘導(dǎo)次級(jí)sRNA的合成。
　　 2 TYLCCNB編碼的βCl蛋白抑制甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平基因沉默研究
　　 對(duì)TYLCCNV抑制甲基化和轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(Trans

5、criptional gene silencing,TGS)開展了研究,亞硫酸氫鹽測(cè)序表明TYLCCNV基因組DNA在TYLCCNV單獨(dú)侵染的本氏煙中能夠發(fā)生甲基化,且甲基化主要集中于病毒啟動(dòng)子區(qū),包括基因間隔區(qū)(含有病毒復(fù)制起點(diǎn)和雙向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子)、AV2區(qū)(含有AV1／CP啟動(dòng)子)以及AC2／AC3的啟動(dòng)子區(qū)。TYLCCNB與TYLCCNV共同侵染能夠降低TYLCCNV全基因組的甲基化水平,使其從5.4％降到1.25％。農(nóng)桿菌接種實(shí)驗(yàn)

6、表明TYLCCNB能夠互補(bǔ)甜菜曲頂病毒(BCTV)L2-突變體,阻止次級(jí)侵染組織發(fā)生回復(fù),使其胞嘧啶甲基化水平降低15％左右。胞嘧啶延伸實(shí)驗(yàn)表明TYLCCNB與TYLCCNV共同侵染本氏煙能夠使寄主基因組的甲基化水平降低2.5倍左右。與甜菜曲頂病毒病毒(BCTV)不同的是,雖然TYLCCNV也編碼了AC2／AL2蛋白,但是TYLCCNV整個(gè)病毒并不能有效的抑制TGS,而TYLCCNB與TYLCCNV或者BCTV L2-突變體共同接種卻能

7、夠回復(fù)16-TGS本氏煙中轉(zhuǎn)錄水平沉默的GFP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。βC1還能回復(fù)16-TGS本氏煙中轉(zhuǎn)錄水平沉默的GFP轉(zhuǎn)基因的表達(dá),并且能夠激活擬南芥中F-box等內(nèi)源表觀沉默位點(diǎn)的表達(dá),顯著降低擬南芥基因組的甲基化水平。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明βCl能夠在體內(nèi)與甲基循環(huán)中的關(guān)鍵酶S一腺苷高半胍氨酸水解酶(SAHH)A作,體外SAHH活性測(cè)定試驗(yàn)表明βCl與SAHH互作后能夠使SAHH的活性降低80％左右。上述研究及已有的報(bào)道表明

8、雙生病毒及其伴隨的betasatellite編碼的蛋白能夠通過不同的方式抑制甲基循環(huán)的腺苷甲硫氨酸(SAM),從而達(dá)到抑制甲基化和TGS的效果。
　　 3番茄黃曲葉病毒自然種群的分子變異分析
　　 為了追蹤番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)在我國(guó)的發(fā)生和進(jìn)化規(guī)律,于2006到2010年從上海采集了26個(gè)TYLCV的分離物并且利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)獲得122條TYLC

9、V的全長(zhǎng)基因組序列。序列分析表明所獲得的122條TYLCV的全長(zhǎng)基因組序列的同源性為98.5％-100％,且每年每個(gè)位點(diǎn)的平均替代率為1.69×10-3,表明TYLCV具有與RNA病毒相似的變異速度。對(duì)TYLCV的基因間隔區(qū)(IR)以及各個(gè)編碼區(qū)的序列進(jìn)行分子變異分析表明IR區(qū)的變異最大,且每年每個(gè)位點(diǎn)的平均替代率為4.81×10-3。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TYLCV的變異是由堿基替代引起的,且堿基替代存在一定的傾向性,主要偏向于C→T、T→C

10、、G→A和G→T的轉(zhuǎn)換。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明雙生病毒具有與RNA病毒相似的進(jìn)化變異速率。
　　 4番茄黃曲葉病毒在煙粉虱介體內(nèi)的分子變異分析
　　 為了了解TYLCV在煙粉虱介體內(nèi)的分子變異情況,以TYLCV侵染性克隆接種的番茄作為毒源分別讓入侵Q型煙粉虱和土著ZHJ2型煙粉虱取食,并利用RCA技術(shù)測(cè)定煙粉虱取食12 h和15 d后其體內(nèi)的TYLCV全長(zhǎng)基因組序列。序列分析發(fā)現(xiàn)TYLCV在Q型和ZHJ2型煙粉虱體內(nèi)的

11、平均替代率分別為4.08×10-3和3.45×10-3,表明TYLCV在煙粉虱體內(nèi)具有種群遺傳多樣性和快速的變異速率。遺傳差異分析表明TYLCV在煙粉虱介體內(nèi)的變異速率顯著高于其在寄主番茄中的變異速率(2.02×104.3.66×104)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),TYLCV在煙粉虱介體內(nèi)的高突變頻率是由于在多個(gè)位點(diǎn)頻繁發(fā)生突變引起的,且突變類型存在一定的偏好性,偏向于C→T、G→A、A→G和T→G的轉(zhuǎn)換,該研究結(jié)果表明煙粉虱可能在TYLCV的變