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1、細(xì)胞色素P450(cytochromeP450,CYP)是參與眾多外源物和內(nèi)源物在體內(nèi)代謝失活/活化的重要酶系,主要存在于肝微粒體中。P450酶系統(tǒng)具有專一性低、個(gè)體差異大、易受誘導(dǎo)或抑制等特點(diǎn)。在藥物代謝過(guò)程中往往存在一種CYP亞族參與多個(gè)藥物代謝、一種藥物由多個(gè)CYP亞族催化代謝的現(xiàn)象。同時(shí),許多藥物既是某種藥酶的底物,也可能是該種酶或其他酶的誘導(dǎo)劑或抑制劑,當(dāng)多種藥物聯(lián)合用藥時(shí),有可能導(dǎo)致其中一種藥物發(fā)生代謝障礙或加快代謝速度,使
2、發(fā)生毒副反應(yīng)或藥物無(wú)效。 Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人的結(jié)腸腺癌細(xì)胞,作為一個(gè)人小腸黏膜的體外模型被廣泛應(yīng)用。Caco-2細(xì)胞可以用于體外藥物吸收研究,因?yàn)檫@種細(xì)胞與小腸上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和功能上具有相似性,如同樣表達(dá)細(xì)胞色素P450酶和P-糖蛋白。 佐米曲坦是一種新型的5-HT1B/1D受體激動(dòng)藥,臨床上用于偏頭痛的治療。佐米曲坦的體外研究報(bào)道很少,所以本文從代謝和吸收兩方面對(duì)佐米曲坦進(jìn)行了體外研究,為其今后臨床安全,合理,
3、有效應(yīng)用,避免或減少不良反應(yīng)發(fā)生,提供科學(xué)依據(jù)。全文分為兩篇從四部分進(jìn)行研究: 上篇佐米曲坦的體外代謝機(jī)理研究 第一部分佐米曲坦在鼠肝和人肝微粒體中的體外代謝研究以誘導(dǎo)鼠肝微粒體和人肝微粒體為模型研究佐米曲坦的體外代謝機(jī)理和可能的藥物代謝相互作用,以期指導(dǎo)臨床合理用藥。1)佐米曲坦在經(jīng)BNF誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中代謝強(qiáng)烈,代謝產(chǎn)物為N-去甲基佐米曲坦,而在經(jīng)PB和DEX誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中代謝不是很明顯。說(shuō)明在鼠肝微粒體中佐米
4、曲坦也經(jīng)CYP1A2代謝。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint分別為96±22μmol·L-1,11±3pmol·min-1·mgprotein-1和0.12±0.02μl·min-1·mgprotein-1。氟伏沙明和地非三唑強(qiáng)烈抑制佐米曲坦的N-去甲基化代謝(Kt分別為70±11和90±18μmo1·L-1),地西泮和普萘洛爾能抑制佐米曲坦的N-去甲基化代謝(Ki分別為3.8±0.3和3.2±0.1μmol·L-1),西米替丁和嗎
5、氯貝胺對(duì)佐米曲坦的N-去甲基化代謝沒(méi)有明顯抑制作用。氟伏沙明對(duì)鼠肝微粒體中CYP1A2具有時(shí)間和濃度依賴性失活作用。2)i.普羅帕酮對(duì)映體、尼古地平對(duì)映體、普萘洛爾對(duì)映體和維拉帕米對(duì)映體對(duì)佐米曲坦在鼠肝微粒體中的N-去甲基化代謝都具有抑制作用而且都具有立體選擇性。ii.建立手性高效液相色譜法(手性分析柱為ChiralpakAD-H)測(cè)定佐米曲坦對(duì)映體濃度。發(fā)現(xiàn)在鼠肝微粒體中S-佐米曲坦的代謝速度顯著快于R-佐米曲坦的代謝速度。兩對(duì)映體的
6、代謝存在相互作用,S-對(duì)映體對(duì)R-對(duì)映體的代謝抑制作用強(qiáng)于R-對(duì)映體對(duì)S-對(duì)映體的代謝抑制作用(IC50S/R為0.11+0.01μg·ml-1,IC50R/S為4.97+0.23μg·ml-1)。iii.佐米曲坦對(duì)映異構(gòu)體在人肝微粒體中的N-去甲基化代謝也存在立體選擇性。S-對(duì)映體的代謝速度快于R-對(duì)映體。普羅帕酮對(duì)映體對(duì)佐米曲坦在人肝微粒體中的N-去甲基化代謝也存在立體選擇性。3)佐米曲坦對(duì)人肝微粒體中CYP1A2,2B,2C9,2
7、C19,2D6和3A4都沒(méi)有顯著性抑制作用,IC50遠(yuǎn)大于100μmol·L-1。 第二部分佐米曲坦對(duì)大鼠肝細(xì)胞中CYP3A1/2的誘導(dǎo)作用研究佐米曲坦對(duì)大鼠肝中細(xì)胞色素P450酶表達(dá)的影響。采用探針底物檢測(cè)幾種主要細(xì)胞色素P450酶的可能活性變化,并以RT-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)的變化情況。低、中和高劑量的佐米曲坦對(duì)雌性和雄性Sprague-Dawley大鼠肝中的CYP1A2,2B,2C和2E1的活性以及對(duì)雌性大鼠的CYP3
8、A1/2都沒(méi)有顯著誘導(dǎo)作用。但是,經(jīng)佐米曲坦誘導(dǎo)的雄性大鼠肝微粒體與經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的鼠肝微粒體相似,對(duì)睪酮、地西泮和硝苯地平都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的代謝活性。用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)佐米曲坦誘導(dǎo)的雄性大鼠肝中CYP3A1和CYP3A2mRNA水平都明顯提高,而雌性大鼠肝中CYP3A1和CYP3A2mRNA水平都沒(méi)有提高。說(shuō)明佐米曲坦對(duì)雄性大鼠肝中CYP3A1和CYP3A2具有誘導(dǎo)作用。 下篇佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞中的攝取和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研
9、究 第一部分佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞中的攝取研究觀察佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞中的攝取情況以及一些可能聯(lián)合給藥的藥物對(duì)佐米曲坦攝取率的影響。采用Caco-2細(xì)胞單層進(jìn)行研究。佐米曲坦的攝取率受體系溫度和pH值的影響較大。當(dāng)體系溫度從23℃升高到39℃時(shí),佐米曲坦的攝取率提高到2.1倍;當(dāng)體系pH值從6.0升高到8.0時(shí),佐米曲坦的攝取率提高到2.7倍。隨著體系藥物濃度的升高(1~25mmol·L-1),佐米曲坦在絨毛面(api
10、calside,AP)的攝取率呈現(xiàn)飽和趨勢(shì),Vmax,Km和Kd值分別為75.6+26.4μmol·h-1·g-1protein,15.3+4.5mmol·L-1和1.3±+0.4ml·h-1·g-1protein。但是,佐米曲坦在基底面的攝取率隨藥物濃度的升高呈線性升高,在此濃度下未呈現(xiàn)飽和趨勢(shì)。佐米曲坦在基底面的攝取率是在絨毛面攝取率的3~7倍。維拉帕米、尼莫地平、硝苯地平、氟桂利嗪、阿米洛利和舒馬曲坦能顯著提高佐米曲坦在絨毛面的攝
11、取率。普羅帕酮能同時(shí)降低佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞單層兩側(cè)的攝取率。普萘洛爾和阿司匹林對(duì)佐米曲坦的攝取沒(méi)有顯著性作用。R-和S-佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞單層兩側(cè)的攝取沒(méi)有立體選擇性。西替利嗪和阿替洛爾單體都能顯著抑制佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞單層雙側(cè)的攝取,但是,各單體之間并不存在立體選擇性差異。R-和S-普萘洛爾對(duì)佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞單層雙側(cè)的攝取存在立體選擇性差異。 第二部分佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究
12、研究佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理以及一些可能聯(lián)合給藥的藥物對(duì)佐米曲坦跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。在12孔Transwell板上培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞單層,并以此為模型進(jìn)行研究。佐米曲坦的透過(guò)率受體系pH值的影響較大。當(dāng)體系pH值從6.0升高到8.0時(shí),佐米曲坦的表觀滲透系數(shù)(Papp)提高了3.8倍。佐米曲坦從AP到BL和從BL到AP的透過(guò)率隨著時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的升高都基本上呈線性上升,且在0.1~10mmol·L-1濃度范圍內(nèi)無(wú)飽和趨勢(shì)
13、,說(shuō)明佐米曲坦的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)主要以被動(dòng)擴(kuò)散為主。佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞單層基底面和絨毛面的表觀滲透系數(shù)(Papp)的比值都在1.4~2.6之間,以及維拉帕米、硝苯地平和尼莫地平三種P-糖蛋白的抑制劑能顯著抑制佐米曲坦從絨毛面到基底面的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)顯著增加佐米曲坦從基底面到絨毛面的轉(zhuǎn)運(yùn),說(shuō)明有P-糖蛋白的外排作用存在。氟桂利嗪和普萘洛爾同時(shí)抑制佐米曲坦在Caco-2細(xì)胞兩側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。舒馬曲坦能顯著增加佐米曲坦從絨毛面到基底面的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)降
14、低佐米曲坦從基底面到絨毛面的轉(zhuǎn)運(yùn),但沒(méi)有顯著性差異。阿司匹林能顯著降低佐米曲坦從基底面到絨毛面的轉(zhuǎn)運(yùn),但是對(duì)其從絨毛面到基底面的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有顯著性影響。與舒馬曲坦相似,阿米洛利能顯著增加佐米曲坦從絨毛面到基底面的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)降低佐米曲坦從基底面到絨毛面的轉(zhuǎn)運(yùn),但沒(méi)有顯著性差異。R-和S-佐米曲坦的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)存在立體選擇性,R-佐米曲坦顯著低于S-佐米曲坦。普萘洛爾、西替利嗪和阿替洛爾對(duì)映異構(gòu)體都能顯著抑制佐米曲坦雙側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),但只有普萘洛爾對(duì)
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