食管癌相關(guān)分子功能和納米材料量子點新特性研究.pdf

1、食管癌是我國常見惡性腫瘤,年死亡率居惡性腫瘤第四位,其中主要組織學(xué)類型是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。由于早期癥狀不明顯并缺乏標(biāo)志檢測分子,確診時多為中晚期,預(yù)后較差,5年生存率低于30％。與絕大多數(shù)腫瘤一樣,ESCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今未明。因此,對ESCC發(fā)生發(fā)展過程中異常改變重要分子的功能、特性及其調(diào)控機(jī)制的研究,將有助于發(fā)現(xiàn)診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的新分子靶點,提高食

2、管癌診治水平；同時應(yīng)用新技術(shù)、新材料標(biāo)記腫瘤細(xì)胞并成像,將促進(jìn)分子腫瘤學(xué)研究。
　　 Clusterin(CLU)是一種存在于多種細(xì)胞組份、具有多種存在形式、參與細(xì)胞內(nèi)外重要生命活動功能復(fù)雜多樣的蛋白,近年發(fā)現(xiàn)其表達(dá)改變與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CLU編碼基因位于8p21,為單拷貝基因,可編碼不同的蛋白產(chǎn)物,主要包含分泌型(sCLU)和核型(nCLU)兩種類型。我們實驗室前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ESCC中sCLU表達(dá)降低而n

3、CLU表達(dá)升高。目前,對sCLU的功能及其剪切、加工機(jī)制比較清楚,而對nCLU的定位、機(jī)理和功能卻知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)在nCLU高表達(dá)的ESCC細(xì)胞中,nCLU存在細(xì)胞核仁聚集現(xiàn)象。nCLU的核仁聚集與核仁標(biāo)志分子核仁素(nucleolin)蛋白在細(xì)胞核仁中共定位；其核仁定位具有細(xì)胞周期依賴性,與核仁的組裝及解體過程一致；nCLU的核仁定位依賴于RNA,特別是rRNA的合成；nCLU的核仁定位依賴于CLU的N端富含堿性氨基酸序列。通過R

4、NA干擾降低nCLU的核仁表達(dá)后,rRNA合成受到抑制,細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯；nCLU的核仁定位對細(xì)胞rRNA合成的影響可能通過與RNA聚合酶I相互作用,協(xié)同完成。CLU核仁定位現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)以及功能探討,為進(jìn)一步揭示CLU蛋白的復(fù)雜功能提供了線索。
　　 生長相關(guān)基因產(chǎn)物β(growth—related gene productβ,GROβ)是實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)的在ESCC組織中高表達(dá)分子之一。作為趨化因子,GROβ可以分

5、泌到細(xì)胞外,在ESCC生長代謝中發(fā)揮重要作用。然而,迄今尚無ESCC血清GROβ表達(dá)水平的相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn),GROβ在ESCC血清中表達(dá)顯著升高,通過ELISA檢測血清GROβ表達(dá)水平可能有助于對ESCC的預(yù)后評估。此外,研究發(fā)現(xiàn),GROβ和其下游調(diào)節(jié)分子早期生長相關(guān)基因1(early growth related genel,EGR1)參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性,并通過細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性通路發(fā)揮作用。食管癌患者中GROβ

6、及其下游調(diào)節(jié)分子EGR1持續(xù)高表達(dá)個體較低表達(dá)個體可能對順鉑治療較為敏感。
　　 量子點(Quantum dots,QDs)是由Ⅱ-Ⅵ族元素(如CdSe、CdS等)或Ⅲ-Ⅴ族元素(如InP、InAS)組成的尺寸小于100nm的新型半導(dǎo)體納米微晶體。這類納米級的半導(dǎo)體材料產(chǎn)生的量子效應(yīng)及其獨特的光學(xué)特性使其成為一種理想的無機(jī)熒光染料,可以實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)特殊分子的標(biāo)記及其長時間示蹤成像的效果。本研究探討用不同物理學(xué)特性的QDs標(biāo)記ES

7、CC細(xì)胞并成像,發(fā)現(xiàn)游離的綠色MPA-量子點在DAPI染核及紫外激發(fā)的共同作用下由胞漿迅速轉(zhuǎn)運至胞核,對核成像,這可能與其較小的粒徑及表面所帶電荷相關(guān)。該研究提示,綠色MPA-量子點在細(xì)胞核的穩(wěn)定標(biāo)記中具有重要應(yīng)用前景。
　　 第一部分Clusterin蛋白定位的新發(fā)現(xiàn)及其機(jī)制與功能研究
　　 目的：Clusterin(CLU),是一種存在多種細(xì)胞組分中具有多種存在形式功能復(fù)雜多樣的蛋白,參與細(xì)胞內(nèi)外重要的生命活動,并且

8、與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。CLU被形容成“謎一樣”的蛋白,這主要體現(xiàn)在該蛋白結(jié)構(gòu)的未知性、產(chǎn)生機(jī)制的復(fù)雜性以及功能的多樣性上。編碼CLU的基因位于8p21,這個單拷貝的基因可以編碼不同的蛋白產(chǎn)物,具有不同的細(xì)胞定位,發(fā)揮不同的生物學(xué)功能,主要是分泌型(sCLU)及核型(nCLU)。目前對于sCLU的功能及剪切加工機(jī)制了解的比較清楚,而對于nCLU核定位現(xiàn)象的機(jī)制及其功能卻是知之甚少,本文以nCLU高表達(dá)的食管鱗狀癌細(xì)胞(esopha

9、geal squamous cell carcinoma,ESCC)為模型,旨在揭示nCLU的核定位現(xiàn)象及可能的機(jī)制及功能。方法：提取ESCC細(xì)胞的核組分,通過Western blot檢測CLU蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá),進(jìn)一步通過免疫熒光確認(rèn)CLU蛋白在細(xì)胞核中的定位；通過免疫熒光及激光共聚焦掃描顯微鏡成像檢測CLU蛋白與ku70蛋白,核仁素蛋白,多聚嘧啶束結(jié)合蛋白,RNA聚合酶I蛋白在細(xì)胞中的共定位情況；分別用RNase A及放線菌素D(

10、actinomycine D,Act-D)處理細(xì)胞,檢測CLU蛋白在細(xì)胞中定位的改變；通過RNA干擾技術(shù)抑制CLU蛋白的表達(dá),通過RT-PCR、Western blot及免疫熒光檢測干擾效果；通過RT-PCR及in situ run-onassay方法檢測CLU核仁表達(dá)的減弱對rRNA轉(zhuǎn)錄的影響；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制CLU的表達(dá),對細(xì)胞周期的影響。將CLU全長序列、截短序列及富含堿性氨基酸的序列片段構(gòu)建入含有綠色熒光蛋白(green

11、fluorescence protein,GFP)標(biāo)簽或是HIS標(biāo)簽的載體中,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過熒光顯微鏡檢測蛋白在細(xì)胞中的定位。結(jié)果：在多種ESCC細(xì)胞的核組分中均檢測到nCLU蛋白的表達(dá),并且通過免疫熒光技術(shù)確認(rèn)了這種核定位；在實驗過程中意外的發(fā)現(xiàn),nCLU可以在細(xì)胞核仁中發(fā)生聚集,與核仁的標(biāo)志分子核仁素蛋白在細(xì)胞核仁中共定位；nCLU的核仁定位的特性研究中發(fā)現(xiàn),其核仁定位具有細(xì)胞周期依賴性,與核仁的組裝及解體過程一致；nCLU核仁定位

12、的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn),nCLU的核仁定位依賴于RNA,特別是rRNA的合成；nCLU核仁定位的功能研究發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾降低其核仁表達(dá)后,rRNA的合成受到抑制,并且會使細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期停滯,nCLU的核仁定位會對細(xì)胞rRNA的合成,細(xì)胞周期調(diào)控產(chǎn)生影響。nCLU的核仁定位對于細(xì)胞rRNA的合成的影響可能通過與RNA聚合酶I相互作用,協(xié)同完成；在CLU的N端和C端各有一段富含堿性氨基酸的序列,N端序列在CLU的核仁定位中發(fā)揮一定的作用