伴放線放線桿菌在齦下菌斑中的分布及其細(xì)胞膨脹致死毒素的研究.pdf

1、牙周炎是一種慢性細(xì)菌感染性疾病，能引起牙周結(jié)締組織的破壞和牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落。伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans)是目前公認(rèn)的牙周炎主要致病菌之一,A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans又被稱為伴放線菌嗜血菌(Haemophilusactinomycetemcomitans)，主要存在于齦下菌斑中，能合成分泌多種細(xì)胞毒

2、力因子。大量研究發(fā)現(xiàn)，A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans和局限型侵襲性牙周炎(localizedaggressive periodontitis，LAP)密切相關(guān)。在慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)患者和牙周健康者的齦下菌斑中也經(jīng)常檢測到A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans的存在，但國內(nèi)外學(xué)者對其在慢性牙周炎患者和牙周健康者齦下菌斑中分布的研究結(jié)果差異較大。 為了探索A．a(chǎn)ct

3、inomycetemcomitans在慢性牙周炎患者和牙周健康者齦下菌斑中的分布規(guī)律，本研究采用了目前國際通用的16S rRNA聚合酶鏈反應(yīng)(16Sribosomal RNA polymerase chain reaction，16S rRNA PCR)技術(shù)，檢測慢性牙周炎患者和健康人齦下菌斑中A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans的攜帶率，并分析了A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans分布與牙周臨床指標(biāo)的關(guān)系。

4、 本研究第一部分應(yīng)用16S rRNA PCR技術(shù)檢測慢性牙周炎患者和牙周健康者齦下菌斑中的A.actinomycetemcomitans，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中重度牙周炎患牙位點(diǎn)的A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率為33．62％，顯著高于慢性牙周炎患者相對健康牙和牙周健康者健康牙的位點(diǎn)檢出率(P<0．05)；男性和女性慢性牙周炎患者的A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans位點(diǎn)檢出率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但年輕患者的位點(diǎn)檢出率明顯

5、高于中、老年患者(P<0．05)。 A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在牙周組織破壞嚴(yán)重的患牙位點(diǎn)檢出率要高于破壞較輕的位點(diǎn)。A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在PD>7mm的牙周炎患牙位點(diǎn)的檢出率顯著高于PD 4～6mm的位點(diǎn)，而PD 4～6mm的患牙位點(diǎn)A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率又顯著高于PD≤4mm的位點(diǎn)(P<0．05)。CAL對A．a(chǎn)ctinomycetemcomitan

6、s檢出率的影響也呈相同趨勢，CAL≥6mm的患牙位點(diǎn)檢出率最高，3-5mm次之，CAL≤3mm的患牙位點(diǎn)A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率最低(P<0．05)。此外，在BOP陽性位點(diǎn)的檢出率高于陰性位點(diǎn)，說明A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在炎癥活躍期位點(diǎn)的分布較多。 A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans能合成分泌多種細(xì)胞毒力因子，其中細(xì)胞膨脹致死毒素(cytolethal disten

7、ding toxin，CDT)是一種由三個(gè)蛋白亞基組成的異聚體，具有引起細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡和刺激炎性細(xì)胞因子分泌的功能。目前，細(xì)胞膨脹致死毒素與A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans致病性的關(guān)系已引起國外學(xué)者的廣泛關(guān)注，而國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。 本研究第二部分采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans基因組中的CDT編碼基因cdtABC，將獲取的基因片斷通過TA克隆、限制性

8、酶切和連接，構(gòu)建出pQE60-cdtABC重組質(zhì)粒。測序報(bào)告證實(shí)重組質(zhì)粒中嵌入的cdtABC基因和原始序列的同源性高達(dá)99％。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E coli感受態(tài)細(xì)胞，并用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組CDT蛋白的表達(dá)，通過SDS-PAGE和Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)E. coli感受態(tài)細(xì)胞的總蛋白中有重組CDT蛋白的表達(dá)。綜上所述，慢性牙周炎患者中患牙位點(diǎn)的A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率顯著高于慢性牙周炎患者的相對健康位點(diǎn)和

9、牙周健康者的位點(diǎn)檢出率。A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在年輕的慢性牙周炎患者中檢出率高于中、老年患者，而且它的檢出率還隨著牙周組織破壞程度的加重而升高。本研究進(jìn)一步利用PCR技術(shù)克隆出編碼A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans CDT的cdtABC基因，通過TA克隆成功構(gòu)建了pQE60-cdtABC載體，并在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中成功表達(dá)出重組CDT蛋白，為進(jìn)一步研究CDT蛋白的生物學(xué)活性和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及A.