2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的: 以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特異的RNA干擾(RNAi)腺病毒表達(dá)載體作為研究工具,從轉(zhuǎn)錄后水平抑制GSK-3β基因表達(dá),初步探討Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin),信號(hào)途徑對(duì)人甲狀腺細(xì)胞增殖凋亡的影響。 方法: 設(shè)計(jì)合成針對(duì)GSK-3βmRNA序列的短發(fā)夾RNA(shRNA)編碼序列,克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中,然后通過(guò)體外同源重組構(gòu)建重組RNAi腺病毒表達(dá)載體,在HEK293A細(xì)

2、胞中包裝并擴(kuò)增病毒、空斑實(shí)驗(yàn)法測(cè)定病毒滴度;腺病毒感染原代培養(yǎng)人甲狀腺細(xì)胞,Western blot法檢測(cè)其對(duì)GSK-3β表達(dá)的抑制效應(yīng),并探討不同感染復(fù)數(shù)(MOI)及病毒感染時(shí)間對(duì)GSK-3β的抑制效應(yīng);利用RNAi腺病毒抑制GSK-3β表達(dá),溴脫氧尿苷(BrDU)法檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,探討Wnt/β-catenin信號(hào)途徑對(duì)人甲狀腺細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了GSK-3β特異的RN

3、Ai腺病毒表達(dá)載體,在HEK293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增腺病毒,獲得高滴度腺病毒上清,測(cè)定擴(kuò)增第二代的病毒液滴度在1.6×1010pfu~5.0×1010pfu之間,可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。 2.RNAi腺病毒感染人甲狀腺細(xì)胞后可使GSK-3β表達(dá)量明顯下降,RNAi腺病毒MOI值為100時(shí)可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞GSK-3β表達(dá)的有效抑制;RNAi腺病毒感染后48h開始檢測(cè)到GSK-3β表達(dá)量下降,且隨時(shí)間延長(zhǎng)GSK-3β表達(dá)量進(jìn)一步減少,抑制效

4、應(yīng)可持續(xù)至少6天;RNAi腺病毒感染人甲狀腺細(xì)胞后β-catenin表達(dá)量顯著增加。 3.腺病毒感染人甲狀腺細(xì)胞1day、3day、5day、7day后,RNAi腺病毒組與空病毒組相比,細(xì)胞增殖率明顯增加(P<0.05);但流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果提示RNAi腺病毒感染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不明顯。 結(jié)論: 構(gòu)建的GSK-3β特異的RNAi腺病毒表達(dá)載體能有效抑制GSK-3β基因表達(dá),可以作為研究wnt/β-catenin信號(hào)

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