抗NgR疫苗的研制及其在修復脊髓損傷中的作用.pdf

1、軸突生長抑制分子是成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)（CNS）損傷后不能再生的重要因素之一。迄今已發(fā)現(xiàn)的來源于髓鞘的軸突生長抑制分子主要有三種：Nogo-A，MAG和Omgp，這三種分子有一個共同的受體，稱為Nogo-66受體（NgR）。在脊髓損傷（SCI）后，大量髓鞘破損，髓鞘中的抑制分子被暴露或釋放至損傷環(huán)境中，當神經元軸突上的NgR接觸到環(huán)境中的這些抑制分子時，其生長錐就會發(fā)生坍塌甚至回縮，導致?lián)p傷的軸突不能再生。因此，如果能封閉NgR的功

2、能，就有可能阻斷Nogo-A，MAG和Omgp 的抑制效應。本研究旨在研制一種針對NgR的疫苗，通過疫苗免疫，使機體產生抗NgR抗體，從而阻斷NgR介導的軸突生長抑制效應，并采用大鼠脊髓損傷模型對該疫苗的效果進行評估，以期為中樞神經損傷的修復提供一種新的輔助治療手段。 本文第一部分工作是制備抗NgR的多克隆抗體。利用基因工程手段，原核表達并純化得到NgR分子的一個功能片段LRR，然后將其作為抗原免疫新西蘭兔獲得了高效價的抗體，W

3、estern Blot測定抗體效價>1:50000。利用該方法制備的抗NgR抗體可用于NgR分子的Western Blot及免疫組化檢測，亦可用于NgR的體內外功能試驗研究，為下面的實驗提供了重要工具。 本文第二部分制備了抗NgR的DNA疫苗，并采用重物墜落大鼠脊髓傷模型對該疫苗的效果進行了評估。將人NgR基因片段與人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合構建成真核表達質粒pcDNA3.1-hNgR-Fc，即抗NgR的DNA疫苗。通

4、過將該質粒轉染至培養(yǎng)的COS-7細胞，以及直接將質粒注射至大鼠股四頭肌，我們證明該重組的DNA疫苗能成功表達融合蛋白hNgR-Fc。然后，采用脂質體為佐劑，將該DNA疫苗通過肌肉注射，接種至成年SD大鼠。經過三次免疫，僅少部分個體能撿出低效價的抗NgR抗體（1:200，ELISA）。但免疫大鼠脊髓損傷后，行為學檢測（BBB評分，網格試驗和腳印試驗）結果表明，抗NgR DNA疫苗免疫組大鼠的功能恢復明顯好于生理鹽水對照組，且產生抗NgR抗

5、體的個體功能恢復最佳。組織學結果進一步顯示，疫苗免疫組脊髓損傷空洞體積比對照組縮小了30.8％；免疫組化結果顯示，在損傷后8 w，疫苗免疫組大鼠脊髓組織中有大量的CD8＋T細胞的浸潤，提示抗NgR DNA疫苗免疫主要誘導了T細胞免疫，且該細胞免疫可能有利于脊髓損傷的修復。由于產生抗體的大鼠功能恢復優(yōu)于僅產生細胞免疫的個體，因此，促使疫苗誘導更多抗體是提高疫苗質量的關鍵。為此，本文又進行了NgR蛋白疫苗的研制。 本文第三部分研制了

6、針對NgR的蛋白疫苗，并用大鼠脊髓半橫斷模型和重物墜落傷模型對該疫苗的效果進行了評估。用重組的人NgR蛋白為抗原免疫大鼠后，所有個體均產生了高效價的抗NgR抗體（>1:8000，ELISA）；來自免疫大鼠的抗血清在體外可逆轉抑制分子MAG對小腦神經元突起生長的抑制作用；免疫熒光染色顯示，在脊髓損傷后，外周產生的抗NgR抗體可以進入脊髓損傷處，并可與其靶抗原NgR分子結合。在大鼠脊髓半橫斷損傷模型中，利用生物素化的葡聚糖胺（BDA）對大鼠

7、皮質脊髓束（CST）進行順行標記后，結果顯示，經NgR蛋白免疫的大鼠，75％的個體其部分切斷的神經纖維可發(fā)生再生，并穿越損傷區(qū)，長入損傷的下游，部分個體其軸突再生的距離超過了10 mm；而對照組中，所有標記的神經纖維均停止于損傷部位的上游。在重物墜落脊髓損傷模型中，組織學結果顯示，經NgR蛋白免疫的大鼠在脊髓損傷后，其損傷區(qū)空洞體積顯著縮小。而行為學試驗BBB評分和網格步行試驗的結果則進一步證明，接種NgR疫苗后，兩種動物模型癱瘓后肢的