雪旺細胞分離培養(yǎng)及其與修復神經的自組裝材料作用研究.pdf

1、雪旺細胞(Schwann cells，SCs)是形成周圍神經髓鞘的膠質細胞，1839年德國科學家Theodor Schwann最先描述。移植的雪旺細胞可在周圍神經內存活、增殖、遷移和分化，它可分泌多種神經營養(yǎng)因子(NTFs)、細胞黏附分子和細胞外基質，促進和引導周圍神經軸突的再生。雪旺細胞在周圍神經再生修復過程中起著非常重要的作用，雪旺細胞和功能的恢復被公認為是周圍神經再生的兩個最重要因素。 該論文研究是為了尋找一種分離方法，能

2、在短時間內從新生(1～2天)的Wister大鼠乳鼠的坐骨神經分離和培養(yǎng)出原代雪旺細胞，而且還要求其在數量上達到10<'6>/ml以上，純度達到90％以上，來滿足用人工材料修復缺損的周圍神經的臨床需要。將增值一定數量的雪旺細胞種植于修復周圍神經的自組裝材料(聚乳酸一殼聚糖一硫酸軟骨素，PDLLA-CHS-CS)，檢測自組裝制備的PDLLA-CHS-CS材料的生物相容性和PDLLA-CHS-CS材料對雪旺細胞增值的影響。將PDLLA-CHS

3、-CS材料修復成年Wister大鼠的坐骨神。經，研究PDLL-CHS-CS材料對修復周圍神經的影響。 雪旺細胞的分離采用了組織塊法、熱酶消化法、冷酶分步消化法和冷酶聯(lián)合消化法。神經組織塊通過以上四種不同分離方法得到的細胞，行雙30min差速貼壁后，并對四種方法分離出來的細胞總數、活細胞的數量以及雪旺細胞的純度進行比較，得出冷酶聯(lián)合消化法從分離時間、純度、濃度和細胞活性，均能達到從自體組織快速分離和培養(yǎng)雪旺細胞的要求。 雪

4、旺細胞的培養(yǎng)采用的培養(yǎng)液是DMEM/F12+10％FBS(胎牛血清)，用有絲分裂抑制劑(阿糖胞苷，Ara-C)去除或抑制成纖維細胞生長，用成纖維細胞生長因子(bFGF)使雪旺細胞得到進一步增殖。通過一代的培養(yǎng)，雪旺細胞的濃度達到10<'6>/ml以上，雪旺細胞的純度達到90％以上，在數量和純度上能夠滿足雪旺細胞種植于材料修復周圍神經的需要。用MTT試驗繪制雪旺細胞的生長曲線，得出雪旺細胞的倍增時間在2～7天。雪旺細胞的鑒定采用了常規(guī)HE

5、形態(tài)染色和免疫組織化學染色，免疫組織化學染色使用辣根過氧化物酶標記的抗S-100蛋白細胞免疫組織化學染色和異硫氰酸熒光(FITC)標記的抗NGFRp75蛋白細胞免疫組織化學染色。聚乳酸(PDLLA)，殼聚糖(CHS)具有良好的生物相容性，硫酸軟骨素(CS)是細胞外基質的成分之一，具有促進周圍神經再生的作用。通過靜電自組裝將PDLLA,CHS,CS制備成多層的復合材料，即克服了聚乳酸降解慢等缺點，也克服了殼聚糖機械強度不夠等弱點，再添加一

6、些能促進雪旺細胞增殖的細胞外基質成分，應是一種理想的周圍神經缺損修復材料。通過在PDLLA，CHS,PDLLA-CHS-CS復合材料上種植雪旺細胞進行培養(yǎng)的一段時間進行體外實驗，如：MTT實驗，激光掃描共聚焦顯微鏡和環(huán)掃電鏡觀察材料表面細胞生長的情況。結果顯示PDLLA-CHS-CS復合材料與雪旺細胞具有良好的親和性和良好的生物相容性，而且PDLLA-CHS-CS復合材料相對于基體材料PDLLA，CHS對雪旺細胞的增殖作用更加明顯。