蟾毒靈誘導(dǎo)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402-5-FU凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[背景] 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)內(nèi)在的多藥耐藥性以及化療過程中產(chǎn)牛的獲得性多藥耐藥性是HCC化療失敗的主要原因之一。迄今為止仍沒有發(fā)現(xiàn)用于肝癌化學(xué)治療的有效藥物,開發(fā)新的化學(xué)治療藥物仍然是中晚期肝癌內(nèi)科治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。蟾酥為我國(guó)傳統(tǒng)的抗肝癌中藥材,以蟾酥為主治療肝癌具有非常悠久的歷史。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),蟾酥的有效活性成分——蟾毒靈具有很強(qiáng)的抗肝癌作用,有可能成為克服肝癌多藥耐藥,治療

2、中晚期肝癌的有效藥物。研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈具有抑制耐藥細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,但是其具體機(jī)制如何,在體內(nèi)是否具有相同的作用還值得進(jìn)一步研究。因此,本課題以人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU為研究對(duì)象,在初步證實(shí)蟾毒靈能夠抑制肝癌多藥耐藥細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上,對(duì)其誘導(dǎo)凋亡的作用及機(jī)制進(jìn)行了深入探討,并對(duì)其體內(nèi)抑制肝癌的作用進(jìn)行了初步觀察。 [目的] 研究蟾毒靈誘導(dǎo)人肝癌多藥耐藥BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的作用,并探

3、討其可能機(jī)制。建立人肝癌5-氟尿嘧啶獲得性多藥耐藥裸鼠原位移植瘤模型,評(píng)價(jià)蟾毒靈對(duì)肝癌多藥耐藥模型的抗腫瘤作用。 [方法] 1、蟾毒靈對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU增殖的影響 MTT法觀察蟾毒靈、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、奧沙利鉑、環(huán)磷酰胺對(duì)人肝癌BEL-7402/5-FU獲得性多藥耐藥細(xì)胞株增殖抑制作用。蟾毒靈對(duì)親本及耐藥細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)效、量效關(guān)系。 2、蟾毒靈誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞

4、株凋亡的作用 光鏡觀察不同濃度(1、0.1、0.01 μM)蟾毒靈作用于人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU 24 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察不同濃度蟾毒靈(1、0.1、0.01 μM)作用24 h后細(xì)胞凋亡的特征性熒光分布變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度蟾毒靈(1、0.1、0.01 μM)作用24 h對(duì)人肝癌BEL-7402/5-FU細(xì)胞株細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的作用。 3、蟾毒靈誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡的

5、機(jī)制研究 免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法檢測(cè)蟾毒靈對(duì)人肝癌BEL-7402/5-FU細(xì)胞Bcl-XL及Bax蛋白表達(dá)的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蟾毒靈作用后,人肝癌BEL-7402/5-FU細(xì)胞株線粒體膜電位的變化與時(shí)效關(guān)系,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的改變及蟾毒靈對(duì)Caspase-9作用的時(shí)效-量效關(guān)系,并觀察Caspase-9特異性抑制劑對(duì)蟾毒靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。 4、蟾毒靈

6、對(duì)裸鼠人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU原位移植瘤模型的作用 采用“隧道內(nèi)植入法”建立人肝癌5-氟尿嘧啶獲得性多藥耐藥裸鼠原位移植瘤模型。移植12d后,挑選腫瘤大小相近的裸鼠,隨機(jī)分為生理鹽水組,氟尿嘧啶組(20 mg/kg·d),蟾毒靈組(1 mg/kg·d)及蟾毒靈(1 mg/kg·d)與5-氟尿嘧啶(20 mg/kg·d)聯(lián)合用藥組(交替給藥),給藥14 d。治療結(jié)束后采血行肝腎功能及生化檢查；游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤

7、最大徑和最小徑,計(jì)算腫瘤體積；免疫組化法檢測(cè)生理鹽水組TS蛋白表達(dá)；HE染色行心、肝、腎組織病理學(xué)檢查,同時(shí)觀察肝癌組織病理學(xué)改變；TUNEL法檢測(cè)各組腫瘤組織凋亡率。 [結(jié)果] 1、人肝癌BEL-7402/5-FU細(xì)胞株對(duì)臨床常用化療藥5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、奧沙利鉑、環(huán)磷酰胺的耐藥指數(shù)分別為：18.6±2.85、10.22±2.85、2.12±0.20、5.91±1.08、8.92±2.46,但對(duì)蟾毒靈無明顯

8、交叉耐藥性,蟾毒靈對(duì)人肝癌BEL-7402/5-FU細(xì)胞株的增殖抑制作用呈明顯的濃度依賴性。 2、蟾毒靈處理細(xì)胞24 h后可見部分細(xì)胞變圓、脫落懸浮于培養(yǎng)液中,細(xì)胞體積大小不一,腫脹、固縮的細(xì)胞均可見到,細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、光密度增強(qiáng)。 3、經(jīng)1、0.1、0.01μM蟾毒靈處理人肝癌BEL-7402/5-FU多藥耐藥細(xì)胞后, G0/G1期細(xì)胞分布比例(％)分別為25.58±3.70、48.09±2.49、55,26±1.97

9、,與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。G2/M期比例39.78±1.55、32.14±1.14、19.42±1.04,與對(duì)照組相比及組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 4、1、0.1、0.01 μM 蟾毒靈作用于耐藥細(xì)胞的凋亡率(％)分別為42.58±2.11、23.27±1.02、18.65±1.36,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

10、;且凋亡率1μM處理組高于0.1μM組(P<0.01),0.1 μM組高于0.01 μM組(P<0.01)。 5、免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示耐藥細(xì)胞可見Bcl-XL、Bax表達(dá)。Western blot顯示蟾毒靈組Bcl-XL表達(dá)較耐藥細(xì)胞減少,Bax表達(dá)增加。 6、蟾毒靈作用后,細(xì)胞線粒體膜電位降低(P<0.01);隨蟾毒靈作用時(shí)間延長(zhǎng),線粒體膜電位逐漸降低,6 h與24 h、12 h與24 h組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

11、.01)。 7、蟾毒靈作用后Caspase-3、Caspase-9活性增強(qiáng),與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 加入Caspase廣泛阻斷劑后,活性減弱(P<0.01),而Caspase-8活性未見明顯變化(P>0.05)。蟾毒靈作用6、12、24 h后Caspase-9活性均增強(qiáng),并在24 h內(nèi)呈明顯的時(shí)間、濃度依賴性。 8、蟾毒靈處理后,細(xì)胞凋亡率為(25.37±3.16)％,高于對(duì)照組(P<0.01):

12、Caspase-9特異性抑制劑組細(xì)胞凋亡率為(10.5±2.29)％,低于蟾毒靈組(P<0.01),與空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 9、蟾毒靈對(duì)裸鼠原位移植瘤的影響多藥耐藥裸鼠原位移植瘤模型瘤組織的耐藥蛋白TS呈高水平表達(dá)。蟾毒靈組腫瘤體積與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),蟾毒靈聯(lián)合5-氟尿嘧啶組與蟾毒靈組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Tunel法腫瘤組織細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)顯示,5-氟尿

13、嘧啶組細(xì)胞凋亡率為(8.7±3.21)％與生理鹽水組(5.4±2.53)％比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),蟾毒靈組為(29.7±4.54)％及聯(lián)合用藥組(45.634±5.50)％均高于生理鹽水組(P<0.01),蟾毒靈組高于5-氟尿嘧啶組(P<0.01),聯(lián)合用藥組高于蟾毒靈組(P<0.01)。肝腎功能、生化指標(biāo)蟾毒靈組與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),5-氟尿嘧啶組與生理鹽水組比較AST及CL-、K+水平差異有

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 [結(jié)論] 1、人肝癌多藥耐藥BEL-7402/5-FU細(xì)胞株對(duì)蟾毒靈無明顯的交叉耐藥性,蟾毒靈對(duì)其具有增殖抑制作用；蟾毒靈對(duì)裸鼠原位移植瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用,對(duì)裸鼠心肝腎等臟器無明顯毒副作用。2、蟾毒靈能誘導(dǎo)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡；3、增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)、降低抗凋亡蛋白Bcl-XL表達(dá),促進(jìn)線粒體膜電位耗散繼而活化Caspase-9可能是蟾毒靈誘導(dǎo)