重組人腸三葉因子對(duì)腸上皮細(xì)胞移行能力的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察重組人腸三葉因子(recombinant human intestinal trefoil factor, rhITF)對(duì)腸上皮細(xì)胞移行能力的影響并探討其作用機(jī)制。
　　方法：⑴實(shí)驗(yàn)用藥：采用本實(shí)驗(yàn)室重組表達(dá)的人腸三葉因子(rhITF)作為細(xì)胞刺激藥物，該重組蛋白純度達(dá)到98％以上，符合臨床前藥物研究標(biāo)準(zhǔn)。⑵細(xì)胞模型：以傳代培養(yǎng)的人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株為研究模型，購(gòu)置于中科院細(xì)胞所，鑒定正確后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，再將傳至第

2、5-10代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。⑶實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌緦?shí)驗(yàn)采用多個(gè)分組模式，涉及的實(shí)驗(yàn)組包括：陰性對(duì)照組和不同濃度的rhITF組；正常對(duì)照組、用藥3h組、6h組、12h組和24h組；正常對(duì)照組、rhITF組和rhITF+抑制劑組；陰性對(duì)照組、rhITF組和rhITF+抑制劑組。⑷培養(yǎng)條件：陰性對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)液；rhITF組：撤掉血清后分別給予10μg/ml rhITF、25μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF；正

3、常對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)液+10%小牛血清；不同時(shí)相點(diǎn)組：固定rhITF濃度為50μg/ml，分為3h、6h、12h和24h組；正常對(duì)照組：同(2)；rhITF組：50μg/ml rhITF；rhITF+抑制劑組：50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黃酮；陰性對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)液；撤掉血清后分別加入50μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黃酮。⑸檢測(cè)指標(biāo)：細(xì)胞移行：采用Transwell法

4、，觀察腸上皮細(xì)胞移行能力的變化；黏附分子細(xì)胞定位和熒光表達(dá)：采用免疫熒光法檢測(cè)黏附分子β-Catenin和E-Cadherin在腸上皮細(xì)胞的定位和熒光表達(dá)情況；黏附分子含量：采用Western Blot法觀察黏附蛋白β-Catenin和E-Cadherin的蛋白表達(dá)變化；黏附分子磷酸化水平檢測(cè)：采用Western Blot法檢測(cè)磷酸化β-Catenin的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①rhITF促細(xì)胞移行能力隨其濃度的增加而增強(qiáng)。50

5、μg/ml rhITF組細(xì)胞數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組、10μg/ml rhITF組和25μg/ml rhITF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；25μg/ml rhITF組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而10μg/ml rhITF組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。②β-Catenin和E-Cadherin熒光表達(dá)和蛋白表達(dá)均受到rhITF抑制，與正常對(duì)照組、3h組、6h組和24h組比較，12h組

6、熒光表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯減弱(P＜0.05)。③在rhITF的刺激下，與正常對(duì)照組、3h組、6h組和24h組比較，12h組磷酸化β-Catenin的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。④在rhITF和抑制劑（染料木黃酮）刺激下，rhITF組磷酸化β-Catenin的蛋白表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照組和rhITF+抑制劑組(P<0.05)。⑤抑制β-Catenin磷酸化后能明顯降低rhITF促進(jìn)細(xì)胞移行的能力。rhITF組細(xì)胞數(shù)顯著高于陰性對(duì)照組和rhI