綠茶中新型天然抗氧化肽的分離純化、性能及胰蛋白酶抑制作用的研究.pdf

1、茶葉在我國種植并加以飲用已有近千年的歷史，其作為中國人民的傳統(tǒng)飲料，是世界三大無酒精飲料之一，其中健康飲料排名第一的是綠茶。中國唐代的陳藏器在其《本草拾遺》中就指出：“茶為萬病之藥”，這是古人對(duì)茶的醫(yī)用功效的高度概括，因此，研究茶的生物活性物質(zhì)，具有十分重要的意義和價(jià)值。本研究以干綠茶為原料，通過溶劑浸提、飽和硫酸銨鹽析、冷凍離心及透析脫鹽后得到綠茶多肽蛋白粗提液，然后經(jīng)過分子篩凝膠過濾層析分離技術(shù)進(jìn)一步分離純化，得到新型的具有抗氧化活

2、性的綠茶多肽；同時(shí)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的方法分析鑒定分離純化了的綠茶抗氧化肽的純度及分子量，并以清除自由基的能力來分析綠茶抗氧化肽的抗氧化性和穩(wěn)定性等性能；最后初步探討了綠茶抗氧化肽的胰蛋白酶抑制作用和效果。在本研究中，我們分離純化得到了一種新型的綠茶抗氧化肽，綠茶抗氧化肽對(duì)超氧陰離子自由基（O2·-）和羥自由基（·OH）都具有很好的清除作用，同時(shí)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和良好的胰蛋白酶抑制作用。以上研究，為綠茶中新型、天

3、然安全的抗氧化肽的開發(fā)應(yīng)用和深入探索，提供了理論和實(shí)際基礎(chǔ)以及技術(shù)支持。
　　本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　1.綠茶粗蛋白的提取制備
　　干綠茶粉通過磷酸緩沖溶液的浸提，然后進(jìn)行40％飽和硫酸銨鹽析沉降，冷凍離心后取沉淀，沉淀物溶解后經(jīng)截留分子量為3000Da的透析袋透析除鹽后得到綠茶粗蛋白提取物。利用鄰苯三酚的方法對(duì)粗蛋白提取物進(jìn)行抗氧化活性的檢測(cè)，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）確定其分子量范圍。結(jié)果表

4、明，綠茶粗蛋白提取物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并且其蛋白分子量主要分布在2~31KDa之間，2~25KDa之間的蛋白尤為明顯。
　　2.綠茶抗氧化肽的分離純化
　　采用葡聚糖-G75（Sephadex-G75）凝膠過濾層析技術(shù)對(duì)綠茶粗蛋白提取物進(jìn)行分離純化，收集具有抗氧化活性的分離蛋白，冷凍干燥后用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）確定其純度。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，分離純化的蛋白只有一條條帶，測(cè)得其分子量大約為1

5、2023Da。根據(jù)以上結(jié)果分析，綠茶中的天然抗氧化肽經(jīng)凝膠過濾層析后得到了完全純化，達(dá)到了電泳純。
　　3.綠茶抗氧化肽的性能研究
　　對(duì)純化的綠茶抗氧化多肽進(jìn)行抗氧化活性，包括清除超氧陰離子自由基（O2·-）和羥自由基（·OH）能力、穩(wěn)定性，包括熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性等性能研究。結(jié)果表明，綠茶抗氧化多肽具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其清除O2·-和·OH的IC50分別為0.069μg/ml、4.991μg/ml，其中

6、清除O2·-的能力遠(yuǎn)高于同等濃度Vc清除O2·-的能力。同時(shí)研究表明綠茶抗氧化多肽具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，當(dāng)溫度高于100℃時(shí)仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，其對(duì)pH以及乙醇等有機(jī)溶劑也表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在pH3.0-11.0之間都很穩(wěn)定。
　　4.綠茶抗氧化肽的胰蛋白酶抑制作用的研究
　　探討了綠茶抗氧化肽的胰蛋白酶抑制作用與效果，通過苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（BAPNA）法測(cè)定不同濃度綠茶抗氧化肽的胰蛋白酶抑制活性。結(jié)果表