基于HCV 6Kb擴(kuò)增子的動態(tài)準(zhǔn)種優(yōu)勢株的確定及包膜2基因正選擇位點分析.pdf

1、背景和目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染已成為全球性公共衛(wèi)生問題,據(jù)估計全球約有2.1億HCV感染者,其中85％發(fā)展成為慢性丙型肝炎?，F(xiàn)有的抗HCV治療方案十分有限且迄今尚無有效的疫苗問世。HCV有效的免疫逃逸策略是HCV持續(xù)感染及疫苗研究困難的關(guān)鍵問題,但免疫逃逸的機(jī)制尚不清楚。研究表明,病毒適應(yīng)環(huán)境的高度可變性的發(fā)生機(jī)制而非宿主免疫防御功能的缺陷或損傷,可能在病毒免疫逃逸中起更重要的作用。HCV具有

2、明顯的異質(zhì)性,以一群不同但密切相關(guān)的變異株即準(zhǔn)種(quasispecies,QS)存在于感染者體內(nèi)。研究表明準(zhǔn)種具有兩個顯著特性,其一是準(zhǔn)種群體內(nèi)變異株的分布是不均勻的,總以一種變異株為優(yōu)勢株即主要變異株(dominant variants)；其二是是準(zhǔn)種的優(yōu)勢變異株處于動態(tài)變化中,研究顯示同一個體在不同的時間點準(zhǔn)種的主要變異株是不同的,主要變異株的遷移可能反映了宿主的免疫壓力及病毒的強(qiáng)大適應(yīng)性。由此可見,動態(tài)變化的HCV準(zhǔn)種優(yōu)勢株蘊藏

3、著病毒免疫逃逸的相關(guān)信息。對動態(tài)變化的HCV準(zhǔn)種優(yōu)勢株長片段序列分析,以獲得序列的變異特征及進(jìn)化規(guī)律,是探索HCV免疫逃逸分子基礎(chǔ)的新途徑,而建立基于HCV長序列的、準(zhǔn)確的、動態(tài)變化的準(zhǔn)種優(yōu)勢株的鑒定方法是準(zhǔn)種優(yōu)勢株相關(guān)研究的重要前提。
　　 HCV包膜2基因在HCV基因組中變異程度最高,是公認(rèn)的受到宿主免疫壓力即正選擇壓力(positve selection pressure)作用最強(qiáng)的區(qū)域。位于宿主強(qiáng)烈免疫壓力作用下的位點發(fā)

4、生變異,可能引起其蛋白功能發(fā)生相應(yīng)的變化,有利于新的變異株發(fā)生免疫逃逸,躲避宿主的免疫清除。如果一個氨基酸位點非同義核苷酸替代速率(dN)顯著地超過其同義核苷酸替代速率(dS),那么我們稱這個位點為正選擇位點。目前,E2基因正選擇位點的相關(guān)研究報道有限。
　　 本研究從中國人HCV感染患者系列標(biāo)本庫(cQueen cohort)中篩選出未抗病毒治療的1b型HCV慢性感染者的系列血清樣本,進(jìn)行了6Kb的長鏈RT-PCR擴(kuò)增及克隆,

5、建立了基于6Kb長序列的動態(tài)變化的準(zhǔn)種優(yōu)勢株的鑒定方法。同時,用固定效應(yīng)似然法(fixed effects likeli-hood method,FEL)對基于6Kb長片段的E2基因的正選擇位點進(jìn)行了分析,初步探討了E2基因的正選擇位點分布及其與已知功能區(qū)之間的關(guān)系。
　　 材料和方法:
　　 1.HCV5'端6Kb長鏈RT-PCR擴(kuò)增及高效克隆:從中國人HCV感染患者系列標(biāo)本庫(Cqueen cohort)中篩選出3例

6、未經(jīng)IFN抗病毒治療的1b型HCV慢性感染者及其3個不同時間點共9份血清樣本作為研究對象,各樣本兩兩間隔時間為半年以上,HCVRNA＞610g10 copies/ml。根據(jù)GenBank中所有已知的HCV1b型全基因組序列,選擇相對保守、GC含量適當(dāng)?shù)膮^(qū)域,設(shè)計RT引物及巢式PCR擴(kuò)增引物,其中正向引物與本研究小組已建立的5.2Kb擴(kuò)增方法所用的J下向引物相同,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為6,030bp。采用SuperScriptTMⅢ Rnase

7、H-逆轉(zhuǎn)錄酶和Platinum高保真DNA聚合酶、優(yōu)化RT及PCR條件,以期獲得清晰、無雜帶的6Kb的目的條帶。采用高效的長片段TOPO(R)XLPCR克隆試劑盒進(jìn)行克隆。
　　 2.HCV6Kb擴(kuò)增子動態(tài)變化的準(zhǔn)種優(yōu)勢株的確定:從患者1的3份系列血清樣本中各隨機(jī)挑選33個陽性克隆(共99個克隆),對E2區(qū)5'端396 bp片段直接測序,采用CLLJSTAL_X、BioEdit、MEGA軟件序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,確定各時間點

8、的準(zhǔn)種主要變異株及主要變異株發(fā)生更替的時間間隔；從33個陽性克隆中(準(zhǔn)種復(fù)雜程度較高的時間點)隨機(jī)挑選10,15,20,25,30個克隆,各重復(fù)100次,組成5組,用x2檢驗確定能準(zhǔn)確檢出準(zhǔn)種優(yōu)勢株所需的最少克隆數(shù)；用第2、3例患者對上述結(jié)果進(jìn)行驗證。
　　 3.基于HCV6Kb長序列的E2基因正選擇位點分析及其功能意義:用HyPhy軟件包(http://www.hyphy.org/)內(nèi)嵌的固定效應(yīng)似然法(fixed effec

9、ts likelihood method,FEL)檢測各患者基于6Kb長序列的E2基因的正選擇位點,將所檢測到的位點與E2基因已知功能區(qū)進(jìn)行比對,分析各位點的功能意義。
　　 主要結(jié)果:1.建立了HCV5'端6Kb長鏈RT-PCR擴(kuò)增及高效克隆的方法:通常HCV RNA定量≥6 log10 copies/ml的血清標(biāo)本擴(kuò)增均可獲得陽性條帶,目的條帶亮度高,特異性好。將PCR回收產(chǎn)物連接于pCR(r)-XL-TOPO(r)T載體,

10、每個LB平板上可獲得200～800個轉(zhuǎn)化克隆,用EcoR I內(nèi)切酶酶切鑒定,陽性克隆比例大于95％。
　　 2.建立了6Kb擴(kuò)增子動態(tài)變化的準(zhǔn)種優(yōu)勢株的鑒定方法:系譜分析顯示每個患者3個時間點的準(zhǔn)種主要變異株分別位于3個不同的進(jìn)化枝；25及30個克隆的主要變異株與總體33個克隆的主要變異株的檢出完全一致。
　　 3.3例1b型HCV慢性感染者系列血清樣本基于6Kb長序列的E2基因分析,共檢測到5個正選擇位點:通過對每例H

11、CV慢性感染者6Kb長序列的E2基因動態(tài)變化的準(zhǔn)種變異株的適應(yīng)性進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)慢性HCV感染者體內(nèi)的E2區(qū)準(zhǔn)種復(fù)雜程度并非隨著感染時間的延長而進(jìn)行性增高,在某個時間點上準(zhǔn)種變異株的序列可能會趨于一致。在患者1、3共檢測到5個位點:aa384、aa399、aa410、aa475和aa522,分布于HCV E2基因HVR1區(qū)、HVR2區(qū)及HCV E2-CD81分子結(jié)合區(qū)。
　　 主要結(jié)論:
　　 1.建立的HCV5'端6Kb

12、長鏈RT-PCR.擴(kuò)增及高效克隆方法,為HCV免疫逃逸的分子基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.每份血清樣本隨機(jī)挑取25個陽性克隆足以準(zhǔn)確確定HCV慢性感染者體內(nèi)的動態(tài)準(zhǔn)種優(yōu)勢株。HCV感染患者體內(nèi)的病毒準(zhǔn)種優(yōu)勢變異株的進(jìn)化速度較快,半年時間即可發(fā)生更替。
　　 3.慢性:HCV感染過程中,E2基因位于重要功能區(qū)的aa位點受到了宿主強(qiáng)烈的免疫壓力,aa384、aa399及aa410位點的變異可能導(dǎo)致HCV發(fā)生體液免疫逃逸；而