SDF-1-HOXB4融合基因促進輻照小鼠造血重建的研究.pdf

1、前言:
　　一類多能的、具有自我更新能力并具備分化成所有成熟血細(xì)胞潛能的一群原始造血細(xì)胞被稱為造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cells,HSCs),其存在于造血組織中。目前, HSCs移植是治療各種血液系統(tǒng)疾病(惡性血液病、再生障礙性貧血)、免疫性疾病、遺傳性疾病以及多種惡性腫瘤疾病的有效方法之一。隨著當(dāng)前科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進步,盡管人們對于造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用有了更多的了解認(rèn)識,但仍然存在較多問題,如造血干

2、細(xì)胞移植后的造血重建、患者長期生存率均有待進一步解決。因此,我們必須關(guān)注如何才能有效提高HSCs移植的質(zhì)量。造血干細(xì)胞增殖有限、植入率較低是移植后的主要問題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是可分化為各種骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞,MSCs聯(lián)合造血干細(xì)胞共移植能顯著地促進骨髓的造血功能恢復(fù)。主要來源于MSCs的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)及其受體CXCR4在造血干細(xì)胞的動員及歸巢中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)

3、作用。HOXB4是被證實能夠在體內(nèi)外促進造血干細(xì)胞擴增,且不影響HSCs正常分化的轉(zhuǎn)錄因子。其在造血干細(xì)胞中高表達(dá),且能夠有效地增強HSCs的增殖能力。因此我們構(gòu)建了SDF-1/HOXB4融合基因腺病毒表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染經(jīng)體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,將其聯(lián)合臍血CD34+干細(xì)胞經(jīng)小鼠尾靜脈共移植到輻射損傷的NOD/SCID小鼠體內(nèi),探討SDF-1/HOXB4融合基因?qū)毙苑派鋼p傷小鼠造血功能恢復(fù)的作用。
　　研究方法:
　

4、　1.采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法體外分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并繼續(xù)將細(xì)胞培養(yǎng)至第3代。將已構(gòu)建的表達(dá)SDF-1、HOXB4和SDF-1/HOXB4基因的3個腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.采用密度梯度離心法結(jié)合免疫磁珠分選法分選出人臍血CD34+干細(xì)胞,將細(xì)胞過柱2次后備用。
　　3.將NOD/SCID雌性小鼠均給予60Coγ射線照射,照射劑量為350cGy,劑量率為20 cGy/min,

5、將輻照后小鼠按照完全隨機設(shè)計每組各12只分為:①HOXB4/MSCs+CD34+組(HOXB4組):輻照后4小時內(nèi)經(jīng)小鼠尾靜脈分別輸入HOXB4/MSCs(8×105/只)、CD34+細(xì)胞(1×105/只);②SDF-1/MSCs+CD34+組(SDF-1組):SDF-1/MSCs(8×105/只)、CD34+細(xì)胞(1×105/只);③SDF1-HOXB4/MSCs+CD34+組(S-H組):SDF1-HOXB4/MSCs(8×105/

6、只)、CD34+細(xì)胞(1×105/只);④普通 MSCs+CD34+組(MSC-HSC組):未轉(zhuǎn)染MSCs(8×105/只)、CD34+細(xì)胞(1×105/只);○5單純CD34+組(HSC組):CD34+細(xì)胞(1×105/只);○6單純輻照組(IR組):0.3ml生理鹽水。
　　4.每日觀察各組小鼠皮毛、飲食、活動能力及大便等情況并測量體質(zhì)量,記錄各組小鼠存活率。于移植后第7、14、21、28天各組小鼠行斷尾采血,測定白細(xì)胞、血紅

7、蛋白及血小板水平。移植后第14、28天各組分別脫頸處死小鼠2只,行瑞氏染色觀察骨髓細(xì)胞學(xué)變化。
　　5.于移植后第6周脫頸處死小鼠,生理鹽水沖出小鼠股骨、脛骨骨髓。制備單細(xì)胞懸液,用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后,用鼠抗人FITC標(biāo)記的CD45抗體與細(xì)胞懸液避光孵育,PBS洗滌后行流式檢測。
　　研究結(jié)果:
　　1、成功分離培養(yǎng)了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。3個腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染至MSCs并能成功表達(dá)。
　　2、成

8、功分選出臍血CD34+干細(xì)胞,并順利與MSCs聯(lián)合按照實驗分組經(jīng)尾靜脈移植到輻照后的NOD/SCID小鼠體內(nèi)。
　　3、移植后第14天,IR組小鼠存活率明顯低于其余各組,SDF-1組小鼠存活率比HOXB4組、MSC-HSC組、HSC組高,并且S-H組小鼠存活率最高。移植后第28天,各組小鼠仍具相似的變化趨勢,S-H組小鼠存活率仍最高(11/12),而IR組小鼠沒有存活(0/12)。
　　4、IR組小鼠在輻照后2-3周全部死亡

9、。盡管MSC-HSC組、HSC組小鼠在輻照后外周血WBC、HGB、PLT急劇下降,但在7-28天有所恢復(fù)。而S-H組小鼠在第28天外周血完全恢復(fù)正常。雖然SDF-1組小鼠外周血恢復(fù)較HSC組、MSC-HSC組、HOXB4組快,但是仍未完全恢復(fù)正常。
　　5、移植后第14天,IR組骨髓片為油狀外觀,造血細(xì)胞明顯減少;其余各組均有不同程度造血恢復(fù),S-H組、SDF-1組恢復(fù)程度較好,以S-H組最為明顯。移植后第28天,盡管SDF-1組

10、、HOXB4組、MSC-HSC組及HSC組小鼠骨髓造血功能有所恢復(fù),但均未完全恢復(fù)正常;而S-H組小鼠完全恢復(fù)正常。
　　6、移植后第6周S-H組、SDF-1組小鼠骨髓CD45+細(xì)胞百分率明顯高于其余各組,并且S-H組小鼠骨髓CD45+細(xì)胞百分率(47.43±8.89％)最高。
　　結(jié)論:
　　表達(dá)SDF-1/HOXB4融合基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)聯(lián)合臍血CD34+干細(xì)胞(HSCs)共移植能有效促進輻照損傷小