條件性敲除Indian Hedgehog對(duì)出生后小鼠生長(zhǎng)板骨化早期的影響.pdf

1、目的:
　　1、觀察條件性敲除Ihh對(duì)小鼠股骨、脛骨長(zhǎng)度的影響；
　　2、觀察Ihh基因條件性敲除小鼠生長(zhǎng)板開(kāi)始骨化前后一天生長(zhǎng)板組織形態(tài)學(xué)變化，以期觀察到四個(gè)區(qū)的演變過(guò)程；
　　3、初步探討Ihh對(duì)生長(zhǎng)板骨化早期的影響機(jī)制；
　　4、為Ihh異常導(dǎo)致的相關(guān)疾病如：BDA1、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等疾病的防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、取基因型為Col2α1-CreERT2；Ihhfl/fl的剛出

2、生小鼠28只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組Ta組(6天組)、對(duì)照組Ca組（6天組），每組14只。再取Col2α1-CreERT2；Ihhfl/fl的小鼠12只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組Tb組（8天組）、對(duì)照組Cb組（8天組），每組6只。實(shí)驗(yàn)組于出生后第一天開(kāi)始腹腔注射玉米油溶解的TM（Tamoxifen）連續(xù)注射3天。對(duì)照組腹腔注射等量的玉米油作為對(duì)照。
　　2、RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組Ta組、對(duì)照組Ca組,脛骨近端骨骺中Ihh基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，明

3、確其敲除率（n=6）。
　　3、測(cè)量Ta、Ca、Tb、Cb組左股骨、左脛骨長(zhǎng)度，觀察對(duì)股骨、脛骨長(zhǎng)度的影響（n=6）。
　　4、小鼠左脛骨近端X照射及組織切片Von kossa染色，明確實(shí)驗(yàn)組脛骨近端生長(zhǎng)板開(kāi)始骨化的前一天。
　　5、小鼠左脛骨近端生長(zhǎng)板組織切片番紅O染色，觀察脛骨近端生長(zhǎng)板形態(tài)學(xué)變化。
　　6、RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組小鼠脛骨近端生長(zhǎng)板開(kāi)始骨化前一天，脛骨近端骨骺中RUNX2基因mRNA表達(dá)水平的

4、變化（n=6）。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)驗(yàn)組Ta組骨骺中Ihh基因表達(dá)量明顯低于對(duì)照組Cb組（P＜0.05），基因敲除率為65.17％。
　　2、出生后第6天及出生后第8天，實(shí)驗(yàn)組股骨長(zhǎng)度、脛骨長(zhǎng)度較對(duì)照組股骨長(zhǎng)度、脛骨長(zhǎng)度明顯縮短（P＜0.05）。
　　3、脛骨近端X線及生長(zhǎng)板組織切片Von Kossa染色均發(fā)現(xiàn)小鼠在出生后第6天，生長(zhǎng)板均未發(fā)生骨化，而實(shí)驗(yàn)組出生后第8天，生長(zhǎng)板骨化明顯。確認(rèn)條件性敲除Ihh生

5、長(zhǎng)板開(kāi)始骨化前一天為出生后第6天。
　　4、實(shí)驗(yàn)組番紅O染色顯示：生長(zhǎng)板組織結(jié)構(gòu)紊亂，增殖區(qū)消失，未發(fā)現(xiàn)典型的排列成柱狀的增殖區(qū)細(xì)胞，生長(zhǎng)板被肥大軟骨細(xì)胞所占據(jù)，蛋白聚糖分泌減少，分布紊亂。對(duì)照組脛骨近端生長(zhǎng)板組織結(jié)構(gòu)正常。
　　5、實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始骨化前一天脛骨近端骨骺組織RUNX2基因表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　條件性敲除生長(zhǎng)板來(lái)源的Ihh導(dǎo)致小鼠脛骨、股骨長(zhǎng)度縮短，脛骨近端生長(zhǎng)板組織結(jié)