Ⅵ型膠原蛋白對后縱韌帶骨化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 后縱韌帶緊貼脊柱各椎體后方，由枕骨大孔到骶骨，構(gòu)成椎管前壁。后縱韌帶骨化癥(OPLL)是發(fā)生在后縱韌帶內(nèi)的異位骨結(jié)構(gòu)形成。研究認(rèn)為OPLL的發(fā)生首先是后縱韌帶發(fā)生肥厚，在肥厚的基礎(chǔ)上發(fā)生骨化，后縱韌帶肥厚是OPLL的前階段。后縱韌帶骨化的過程包括軟骨內(nèi)骨化和/或膜內(nèi)骨化。無論后縱韌帶骨化是通過軟骨內(nèi)骨化還是膜內(nèi)骨化，其實(shí)質(zhì)是后縱韌帶內(nèi)的成纖維細(xì)胞逐漸增生并被骨細(xì)胞所替代，但這種骨化機(jī)制尚未明確。通過大量臨床和基

2、礎(chǔ)研究證實(shí)，OPLL的發(fā)生由多種因素共同作用引起，包括基因異常表達(dá)、代謝異常、局部應(yīng)力作用等。其中，部分研究認(rèn)為OPLL的發(fā)生與編碼Ⅵ型膠原蛋白(collagenⅥ，CⅥ)a1肽鏈的COL6A1基因異常表達(dá)有關(guān)。CⅥ蛋白作為COL6基因的產(chǎn)物，是細(xì)胞外基質(zhì)的一種纖維蛋白，在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞分化、粘附、增殖、遷移、存活等方面起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)CⅥ蛋白與成骨密切相關(guān)，被認(rèn)為是纖維軟骨分化的標(biāo)志物。在一些罕見的異位成骨，如室骨膜

3、瘤的軟骨骨化中，也發(fā)現(xiàn)CⅥ蛋白出現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)中，并伴隨有細(xì)胞壞死和鈣化現(xiàn)象。本課題前期研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)CⅥ蛋白是其中之一的差異蛋白。
　　 目的:
　　 本研究擬進(jìn)一步明確CⅥ蛋白在正常后縱韌帶組織和骨化后縱韌帶組織中的表達(dá)情況；從正常頸椎后縱韌帶和骨化后縱韌帶組織中分離培養(yǎng)后縱韌帶成纖維細(xì)胞，尋求一種最佳的后縱韌帶成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，了解兩種細(xì)胞的生長特點(diǎn)；為驗(yàn)證CⅥ對OPLL的影響，利用外源性CⅥ蛋白刺

4、激BMP-2誘導(dǎo)骨化的第三代后縱韌帶成纖維細(xì)胞，觀察其對后縱韌帶細(xì)胞增殖及成骨轉(zhuǎn)化的影響，初步探討CⅥ蛋白在OPLL發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制，為OPLL的篩選、診斷和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、取頸椎前路椎體次全切除術(shù)中獲得的OPLL患者后縱韌帶組織和外傷患者正常后縱韌帶組織，利用Western-blot技術(shù)檢測CⅥ蛋白在兩種不同組織中的表達(dá)差異。
　　 2、將取出的兩種后縱韌帶組織采用組

5、織塊細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)獲得后縱韌帶成纖維細(xì)胞，將來源于OPLL患者和外傷患者的細(xì)胞分別記作O細(xì)胞和N細(xì)胞。尋求后縱韌帶成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的最佳方法，了解兩種細(xì)胞的生長特點(diǎn)。以成功培養(yǎng)的第三代成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，收集使用。
　　 3、配制不同濃度的CⅥ蛋白溶液，刺激細(xì)胞，以CCK8(cellcountingkit-8)法分別檢測O細(xì)胞和N細(xì)胞的增殖活性并繪制各自的生長曲線，以探索不同濃度的CⅥ蛋白對兩種細(xì)胞增殖活性的影響。<

6、br>　　 4、在不同濃度CⅥ蛋白刺激的基礎(chǔ)上，利用BMP-2誘導(dǎo)兩種細(xì)胞成骨。為衡量兩種細(xì)胞誘導(dǎo)成骨的能力大小，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)檢測各組細(xì)胞中堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OC)、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2(runt-relatedtranscriptionfactor2，Runx2)mR

7、NA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、CⅥ蛋白在OPLL患者后縱韌帶組織中的相對表達(dá)量為1.34±0.09，在正常頸椎后縱韌帶組織中的相對表達(dá)量為0.68±0.08，前者為后者的1.97倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、通過組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出后縱韌帶成纖維細(xì)胞，組織塊周圍有細(xì)胞爬出，O組標(biāo)本需要14天左右，N組標(biāo)本需要12天左右，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P<0.01)但其細(xì)胞形態(tài)并無差異。

8、在傳代過程中，O組細(xì)胞一般需要4天就可以傳一代，N組細(xì)胞需要5天傳一代，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P<0.05)。在傳至第二、三代時(shí)，兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué)有所差異，O組細(xì)胞表現(xiàn)為肥大，基質(zhì)較多，可見多邊形細(xì)胞；N組細(xì)胞表現(xiàn)為典型的長梭形。
　　 3、CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)在無CⅥ蛋白刺激的情況下，O細(xì)胞生長較快，其高峰期是第4天；N細(xì)胞生長稍慢，其高峰期是第5天。無論是N細(xì)胞還是O細(xì)胞，當(dāng)加入一定濃度CⅥ蛋白刺激后，細(xì)胞增殖能力均大幅提高，且隨著

9、CⅥ濃度增加，其對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用隨之增強(qiáng)，但達(dá)到一定濃度后這種作用會保持不變或減弱。無論何種濃度的CⅥ蛋白刺激，在生長的第1-2天和第5-7天，O細(xì)胞增殖能力和N細(xì)胞增殖能力基本相同，但在細(xì)胞生長的3-4天，O細(xì)胞的增殖能力遠(yuǎn)高于N細(xì)胞，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 4、在無CⅥ蛋白刺激時(shí)，BMP-2誘導(dǎo)細(xì)胞骨化后，通過RT-PCR方法，檢測發(fā)現(xiàn)O細(xì)胞的ALP和Runx2的mRNA表達(dá)均明顯高于N細(xì)胞，存在明顯統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)差異，而OC的mRNA的表達(dá)情況兩種細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同濃度CⅥ蛋白刺激后，兩種細(xì)胞的ALP、Runx2、OC的mRNA表達(dá)均明顯增多。
　　 結(jié)論:
　　 1、CⅥ蛋白作為正常后縱韌帶組織和骨化后縱韌帶組織的一種差異蛋白，在OPLL患者的后縱韌帶組織中表達(dá)明顯增加，可能對后縱韌帶骨化有著重要作用。
　　 2、組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法是一種簡單有效的后縱韌帶成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，來自O(shè)PLL患者的和來自非OPLL患者的

11、后縱韌帶成纖維細(xì)胞生長特點(diǎn)不同，OPLL患者后縱韌帶成纖維細(xì)胞發(fā)生了某種程度的改變。
　　 3、通過外源性CⅥ蛋白對后縱韌帶的刺激，表明CⅥ蛋白能夠促進(jìn)人后縱韌帶細(xì)胞的增殖和成骨轉(zhuǎn)化，而來自O(shè)PLL患者的后縱韌帶細(xì)胞則更易被促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)骨化。
　　 4、后縱韌帶組織中CⅥ蛋白的異常增加，促進(jìn)了后縱韌帶細(xì)胞的增殖和成骨轉(zhuǎn)化。人后縱韌帶組織由增生到骨化，直至發(fā)展成為OPLL，可能與CⅥ蛋白的異常增加有重要關(guān)系，這為將來阻斷