大豆抗花葉病毒侵染過程中胼胝質(zhì)沉積的分子調(diào)控機理研究.pdf

1、本實驗室前期工作已經(jīng)證明,在大豆-大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus,SMV)組成的不親和組合中胼胝質(zhì)在胞間連絲上的沉積是阻礙病毒進行胞間轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵。如在不親和組合中預(yù)注射2-脫氧葡萄糖(胼胝質(zhì)合成抑制劑)后再接種病毒,在病毒侵染部位仍能觀察到壞死斑但胼胝質(zhì)消失,且上位葉片也能觀察到壞死斑出現(xiàn)并能夠檢測到病毒外殼蛋白基因。為了進一步探究在該互作體系中胼胝質(zhì)積累的分子調(diào)節(jié)機制,我們以冀豆7號分別與SMV株系N3和SC-

2、8組成不親和和親和組合,通過免疫組化檢測、實時定量PCR、Westem Blotting檢測、酶活性測定和免疫金標(biāo)記技術(shù)分別在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、酶活性和原位水平對調(diào)控胼胝質(zhì)積累的兩種酶即β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,BG)和胼胝質(zhì)合酶(callose synthase,CalS)進行了系統(tǒng)研究。主要結(jié)果如下:
　　 1、利用免疫組化技術(shù)檢測了大豆與SMV互作過程中BG和CalS定位。試驗結(jié)果表明:壞死斑

3、出現(xiàn)前,接種葉片上能夠標(biāo)記上SMV的細胞也能標(biāo)記上BG和CalS:壞死斑出現(xiàn)后,BG和CalS主要標(biāo)記在壞死斑內(nèi)部及周圍。
　　 2、通過實時定量PCR技術(shù),研究了大豆與SMV互作過程中BG和CalS在轉(zhuǎn)錄水平的變化。試驗結(jié)果表明:BG基因在親和組合和不親和組合中在轉(zhuǎn)錄水平都有上調(diào)表達,并且在不親和組合中上調(diào)表達的時間早于親和組合;CalS基因在不親和組合中接種病毒后48 h就開始上升表達而在親和組合中的表達量一直比較低。

4、>　　 3、利用Western Blotting技術(shù)檢測了大豆與SMV互作過程中BG和CalS在翻譯水平的變化。試驗結(jié)果表明:BG抗體能夠檢測出3種BG亞型,其中28 kDa和37 kDa的兩種亞型在不親和組合、親和組合和模擬接種對照中隨接種后時間的延長均沒有明顯變化,33 kDa的亞型在不親和組合和親和組合中的表達量隨接種時間的延長都逐漸升高,且在不親和組合中的上調(diào)比親和組合提前了24 h,但在模擬接種對照中沒有表達;CalS在不親

5、和組合中接種病毒后48 h就開始表達并且表達量逐漸升高,而在親和組合中接種病毒后96 h才開始表達并且表達量一直比較低。
　　 4、對大豆與SMV互作過程中BG活性和CalS活性的測定結(jié)果表明:不親和組合和親和組合中BG活性都比較高并且在不親和組合中酶活升高的更快;CalS在不親和組合中酶活性比較高,而在親和組合中酶活性一直比較低。
　　 5、利用免疫金標(biāo)記技術(shù)對BG和CalS在大豆與SMV互作過程中的時空表達特征進行了

6、系統(tǒng)研究。試驗結(jié)果表明:BG在不親和組合中主要定位在液泡中,而在親和組合中主要定位在細胞壁和胞間連絲上;CalS在不親和組合和親和組合中都定位在細胞壁和胞間連絲上。
　　 綜合以上結(jié)果,我們認為在大豆與SMV互作過程中胼胝質(zhì)積累的基本調(diào)控模式為:不親和組合中,BG被高度誘導(dǎo)表達但被限制在液泡中不能運輸?shù)郊毎诩鞍g連絲周圍從而不能夠水解胼胝質(zhì);CalS在細胞壁及胞間連絲周圍高度誘導(dǎo)表達促進胞間連絲上胼胝質(zhì)的合成。因此,不親和組合