化濁解毒中藥血清及補骨脂素對肝星狀細胞生物活性的影響.pdf

1、肝纖維化是以結節(jié)形成和肝臟收縮為特征，是肝臟疾病末期的所有并發(fā)癥包括門脈高壓、腹水、肝性腦病、合成及代謝功能障礙的基礎，因此肝纖維化既損傷肝細胞的功能又能增加門靜脈壓力。幾乎在所有的慢性肝損傷的病人中都會產(chǎn)生纖維化，最終形成肝硬化甚至肝癌，嚴重影響人的生命。目前一般認為肝纖維化發(fā)生的原理為：肝纖維化是肝臟發(fā)生慢性非自限性損傷之后的一個創(chuàng)傷修復反應；激活的肝星狀細胞是肝纖維化形成最主要的細胞。
　　 肝纖維化最主要的事件是肝星狀細

2、胞的活化，肝星狀細胞是正常和纖維化肝臟細胞外基質(zhì)的基本來源，是肝細胞和竇內(nèi)皮細胞之間的內(nèi)皮下間隙非游走的竇旁細胞，是體內(nèi)儲存視黃醛衍生物的首要部位，在星狀細胞被激活的過程中，靜止的富含維生素A的細胞轉(zhuǎn)化為高度致纖維化的細胞，其形態(tài)特征為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大、維生素A顆粒減少、核膜皺縮，出現(xiàn)可收縮性的纖維絲及細胞增殖。被激活的肝星狀細胞造成肝纖維化的最直接的方式就是增加細胞外基質(zhì)的形成。細胞外基質(zhì)是指一系列參與構成正常肝和纖維化肝間質(zhì)框架的大分

3、子，包括幾個結構和支撐分子家族：膠原、非膠原糖蛋白、基質(zhì)結合生長因子、黏多糖、蛋白多糖和基質(zhì)細胞蛋白。細胞外基質(zhì)是細胞功能的動態(tài)調(diào)節(jié)器，纖維化肝臟的基質(zhì)成分在性質(zhì)和含量上均有別于正常肝臟，其膠原總含量增加了3～10倍，在肝損傷區(qū)域內(nèi)首先出現(xiàn)的基質(zhì)改變是細胞纖連蛋白的增加，這些變化導致肝星狀細胞的激活和纖維化速度的增加。而激活后的肝星狀細胞表達針對膠原和層粘連蛋白的整合素受體則又有助于基質(zhì)成分的沉積。最終導致細胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，

4、造成細胞外基質(zhì)的過度沉積。
　　 研究表明纖維化在多種疾病中可以被逆轉(zhuǎn)，如酒精性肝病隨著戒酒，其肝纖維化可被顯著逆轉(zhuǎn)；乙肝患者在應用抗病毒藥拉米夫定之后肝纖維化程度也顯著改善；丙肝患者應用干擾素和利巴韋林之后肝纖維化有短期的退化或肝纖維化進展減緩。
　　 目前肝纖維化的治療主要集中在(1)治愈原發(fā)疾病如清除慢性病毒性感染；戒酒和停用有毒性的藥物；去除過剩的鐵和銅；解除膽道梗阻等。(2)減輕炎癥和免疫反應。(3)抑制星狀細

5、胞的活化包括能夠抑制星狀細胞增殖、促進星狀細胞凋亡、抑制膠原等細胞外基質(zhì)的合成；增加細胞外基質(zhì)的降解，起到抗纖維形成的作用。
　　 現(xiàn)在研究多將肝星狀細胞作為治療肝纖維化的靶點。治療上多用抗氧化劑如生育酚、水飛薊素等，可以經(jīng)保護肝細胞和抑制庫普弗細胞功能的雙重作用減少肝損傷。另一類為抑制細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的物質(zhì)，主要是通過直接阻斷基質(zhì)合成和處理或間接抑制轉(zhuǎn)化生子因子(TGF-β)的活性而實現(xiàn)，由于中和轉(zhuǎn)化生長因子能夠取得加速基質(zhì)降解

6、和抑制基質(zhì)產(chǎn)生的雙重效果，所以轉(zhuǎn)化生長因子拮抗劑也是目前的熱點，如松弛肽等。PPAR-γ在星狀細胞內(nèi)有表達，其配體可以下調(diào)星狀細胞的活性，在活化的肝星狀細胞中PPAR-γ表達顯著減少。上調(diào)PPAR-γ表達能夠使肝星狀細胞從激活態(tài)轉(zhuǎn)為靜止態(tài)，從而抑制肝星狀細胞活性。所以本實驗將肝星狀細胞及TGF-β和PPAR-γ作為靶點觀察化濁解毒方的作用機制。
　　 中醫(yī)多將肝纖維化、肝硬化歸為“癥積”“臌脹”“積聚”等范疇。歷代醫(yī)家多認為是由

7、氣血瘀滯造成，多用活血化瘀、軟肝散結之品治療，雖能取效，但是也僅能治標而不治本。經(jīng)過多年的臨床實踐，導師李佃貴教授認為濁毒在肝纖維化形成中起著關鍵作用。濁毒內(nèi)蘊可以影響肝的疏泄功能，導致氣機郁滯，血不歸藏，變生諸癥，日久正虛，濁毒與虛共同致病。故治療上固本與驅(qū)邢不可偏廢，以化濁解毒為大法，兼補益肝腎，經(jīng)多年臨床驗證化濁解毒方在臨床應用中取得良好的效果，但是對其作用機制尚不明確，本實驗從細胞水平觀察化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞的作用，從而

8、探討其作用機制。
　　 在治療肝纖維化的中藥復方中除了大劑量的應用化濁解毒、軟肝散結、活血化瘀之品外，根據(jù)中醫(yī)的辨證論治的原則我們會選擇性的應用一些補益肝腎的藥物其中較常用的是補骨脂，其主要成分是補骨脂素，結合現(xiàn)代研究，在治療肝纖維化中的天然黃酮類藥物的應用如水飛薊素，姜黃素等能夠通過抑制肝星狀細胞的增殖和分化及細胞外基質(zhì)的合成而阻止肝纖維化的發(fā)生和肝硬化的形成。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)補骨脂素也有很多與姜黃素相似的作用，我們推測屬于

9、香豆素類化合物補骨脂素有可能也具有類似的防治肝纖維化作用，所以本實驗觀察補骨脂素對肝星狀細胞增殖及氧化應激的作用，從而觀察其在肝纖維化治療中的作用機理。進而研究化濁毒與抗氧化應激之間是否存在一定聯(lián)系。本研究將分五部分來探討化濁解毒中藥血清及補骨脂素對肝星狀細胞生物活性的影響。
　　 第一部分化濁解毒中藥血清對體外活化肝星狀細胞增殖及凋亡的影響
　　 目的：化濁解毒方是臨床上治療肝纖維化的驗方，但對其作用機理缺乏研究。本研

10、究通過觀察化濁解毒中藥血清對體外培養(yǎng)的活化肝星狀細胞增殖與凋亡的影響，探討化濁解毒方治療肝纖維化的作用機制。
　　 方法：選擇健康的SD大鼠，制備含藥血清，分為干擾素組（陽性對照組），化濁解毒方大、中、小劑量組及空白對照組。體外培養(yǎng)活化的肝星狀細胞，加入各含藥血清進行培養(yǎng)24小時、48小時、72小時，利用MTT法觀察化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞增殖的影響；培養(yǎng)48小時后運用流式細胞儀分析各組肝星狀細胞的凋亡情況。
　　

11、結果：肝星狀細胞在不同濃度化濁解毒中藥血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，與空白對照組比較，大劑量組（0.216士0.051）和陽性對照組（0.232士0.029）有抑制肝星狀細胞增殖的作用(P＜0.05)；培養(yǎng)48h后，化濁解毒中藥血清各劑量組均有抑制肝星狀細胞增殖的作用，其中大劑量組(0.160士0.044)效果更為明顯（P＜0.05），且與陽性對照組（0.20士0.039）比較無差別，其效果優(yōu)于中（0.266±0.046）、小劑量組（0.31

12、5士0.043）（P＜0.05）；培養(yǎng)72h后，陽性對照組和化濁解毒中藥血清各劑量組均有明顯的抑制HSC-T6增殖的作用（P＜0.05），且化濁解毒中藥血清大劑量組效果優(yōu)于陽性對照組(P＜0.05)。
　　 經(jīng)過流式細胞術分析后顯示：肝星狀細胞經(jīng)過含藥血清干預48h后，空白對照組的凋亡率約2.68％,即說明正常的肝星狀細胞也存在著凋亡，陽性對照組15.78％和化濁解毒中藥血清各組的凋亡率均較空白對照組高(P＜0.05)；與陽性對

13、照組比較，化濁解毒中藥血清的大劑量組的細胞凋亡率更高為20.02％(P＜0.05)；中劑量組細胞凋亡率13.38％與陽性對照組沒有明顯差別(P＞0.05)，小劑量組的凋亡率12.88％要低于陽性對照組（P＜0.05）。
　　 結論：化濁解毒中藥血清各濃度組在體外均能夠抑制肝星狀細胞的增殖并誘導其凋亡，同時存在一定的量效關系，即濃度越大其抑制增殖和促進凋亡的作用越強。與干擾素組比較，化濁解毒中藥血清尤其是大劑量組能有效的抑制肝星狀

14、細胞的增殖和誘導其凋亡。
　　 第二部分化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞細胞外基質(zhì)的影響
　　 目的：本部分實驗主要觀察化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞細胞外基質(zhì)尤其是對Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸的影響。
　　 方法：肝星狀細胞加入含藥血清后培養(yǎng)48小時后，運用酶聯(lián)免疫吸附法檢測化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞細胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸的影響。
　　 結果：肝星狀細胞在不同濃度化

15、濁解毒中藥血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，與空白對照組比較，各組均能抑制肝星狀細胞分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸。其中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的含量在大劑量組（分別為117.9ng·mL-1，56.3ng·mL-1）最低，其作用效果明顯優(yōu)于中(158.0ng·mL-1，70.9ng·mL-1)、小劑量組（162.6ng·mL-1，79.6ng·mL-1）及陽性對照組(148.3ng·mL-1，64.3ng·mL-1)(P＜0.05)；

16、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸的含量在大劑量組（60.1ng·mL-1，31.2ng·mL-1）與陽性對照組（60.0±5.1ng·mL-1，32.8±4.1ng·mL-1）均較低，兩組之間無明顯差異(P＞0.05)，均優(yōu)于中藥的中、小劑量組（P＜0.05）。
　　 結論：化濁解毒中藥血清能夠減少體外培養(yǎng)的肝星狀細胞分泌的細胞外基質(zhì)，包括降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸和層粘連蛋白的含量。
　　 第三部分化濁解毒中藥血清對肝星狀細

17、胞TGF-β/Smad4信號通路的影響
　　 目的：觀察化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞內(nèi)TGF-β1mRNA和Smad4mRNA的影響。
　　 方法：運用RT-PCR方法觀察化濁解毒中藥血清各濃度組對TGF-β1mRNA和Smad4mRNA基因表達的影響。
　　 結果：經(jīng)化濁解毒中藥血清干預48小時后，化濁解毒方各劑量組的TGF-β1mRNA表達均較正常血清對照組顯著減少(P＜0.05)。各組的Smad4mRNA表

18、達量均顯著減少(P＜0.05)。
　　 結論：化濁解毒中藥血清抑制肝星狀細胞增殖、促進其凋亡及減少合成細胞外基質(zhì)可能是通過下調(diào)TGF-β1mRNA與Smad4mRNA表達，影響TGF-β/Smad4通路起作用。
　　 第四部分化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞PPARγmRNA的影響
　　 目的：本研究將觀察化濁解毒中藥血清對肝星狀細胞內(nèi)PPARγ的影響，并最終發(fā)現(xiàn)對PPARγ及TGF-β/Smad通路的作用，進一步明

19、確化濁解毒中藥血清抗肝纖維化的作用機制。
　　 方法：運用RT-PCR方法觀察化濁解毒中藥血清各濃度組對PPARγmRNA基因表達的影響。
　　 結果：與空白對照組比較，各組的PPARγmRNA表達量均顯著增加(P＜0.05)。其中化濁解毒中藥血清大劑量組的PPARγmRNA表達量明顯優(yōu)于陽性對照組和中、小劑量組(P＜0.05)。
　　 結論：化濁解毒中藥血清能夠增加肝星狀細胞內(nèi)PPARγmRNA的表達量，以化濁

20、解毒中藥血清大劑量組最為明顯，這也表明了化濁解毒方之所以能干預TGF-β/Smad信號通路可能是通過上調(diào)PPARγmRNA來起作用的。
　　 第五部分補骨脂素對肝星狀細胞的增殖及活性的影響
　　 目的：觀察化濁解毒方中補骨脂所含有的主要成分補骨脂素對肝星狀細胞增殖及活性的影響。
　　 方法：常規(guī)培養(yǎng)肝星狀細胞，并用0.1mmo.L-1的H2O2造成HSC-T6氧化應激的模型。加入補骨脂素，并用MTT法、放射免疫法

21、和ELISA法分別檢測肝星狀細胞增殖、細胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，還原性谷胱甘肽(GSH)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及Ⅰ型膠原的含量。
　　 結果：與正常對照組比較，補骨脂素在濃度為10μmol·L-1，1μmol·L-1，0.1μmol·L-1，均呈現(xiàn)出抑制HSC增殖的作用（P＜0.05），且效果最好的是在作用48h(P＜0.05)；與模型組比較，補骨脂素各個濃度組能夠提高SOD和GSH-

22、PX的活性(P＜0.05)，并降低細胞上清液中MDA和GSH的含量(P＜0.05)；與模型組比較，補骨脂素各個濃度組在作用48h后，細胞上清液中的Ⅰ型膠原的表達量均降低(P＜0.05)。
　　 結論：補骨脂素能有效的抑制肝星狀細胞的增殖及氧化應激，說明補骨脂素是化濁解毒中藥血清治療肝纖維化的物質(zhì)基礎之一，從另一層面上也說明了濁毒導致肝纖維化的機制可能和氧化應激有關，化濁毒的方法之所以能在治療肝纖維化中起作用，很可能與其中的抗氧化

23、成分有關，即化濁毒與抗氧化應激有關。
　　 總論
　　 1 化濁解毒中藥血清各濃度組均能夠抑制肝星狀細胞的增殖。
　　 2 化濁解毒中藥血清各濃度組均促進肝星狀細胞的凋亡。
　　 3 化濁解毒中藥血清各濃度組均能抑制HSCs細胞分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸和層粘連蛋白。
　　 4 經(jīng)化濁解毒中藥血清干預后，化濁解毒中藥血清大劑量組的HSC內(nèi)TGF-β1mRNA表達量明顯降低。
　　 5

24、 化濁解毒中藥血清大劑量組的Smad4mRNA表達量明顯低于中、小劑量組(P＜0.05)。
　　 6 化濁解毒中藥血清大劑量組的PPARγmRNA表達量明顯優(yōu)于陽性對照組和中、小劑量組。
　　 7 化濁解毒方防治肝纖維化的機制可能是通過上調(diào)PPARγmRNA表達而干預肝星狀細胞內(nèi)TGF-β/Smad4信號通路，從而促進肝星狀細胞凋亡和抑制肝星狀細胞的增殖及減少其分泌細胞外基質(zhì)含量而實現(xiàn)的。
　　 8 不同濃度補骨