OATP1B1基因單核苷酸多態(tài)性在利福平所致肝損傷發(fā)病分子機制中的作用研究.pdf

1、背景及目的：
　　 近年來，隨著生物信息學(xué)、藥物基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的蓬勃發(fā)展以及各類新藥的相繼開發(fā)和臨床應(yīng)用，人們越來越強調(diào)醫(yī)療的個體化發(fā)展。研究人類基因的差異性，不僅可以幫助我們了解疾病的起因，并且在臨床上能夠指導(dǎo)我們針對具有差異性基因譜的人群進行個體化治療，以期達到最好的臨床治療效果。另外，在藥物研發(fā)方面，過去對藥物的療效和毒性的研究多側(cè)重于對藥物代謝酶等方面的研究，但是，最新研究發(fā)現(xiàn)藥物的轉(zhuǎn)運蛋白在藥物的體內(nèi)代謝和運輸

2、過程中同樣也發(fā)揮著重要的作用，其中，肝細胞膜上的一系列轉(zhuǎn)運蛋白尤為引人注目。
　　 有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白OATP1B1為僅在人肝臟組織中特異性表達的一種轉(zhuǎn)運蛋白，它定位表達于極性化的肝細胞膜血管面，由691個氨基酸組成，含有12個跨膜區(qū)。其編碼基因含有2175個核苷酸，由15個外顯子組成，位于染色體12p12.2-12.1區(qū)域，跨度約109kb。研究表明，OATP1B1蛋白的功能異常與某些藥物性肝損害密切關(guān)系。其中，OATP1B1

3、與利福平導(dǎo)致的肝損害是近期研究的熱點問題之一。利福平是一種有效的抗結(jié)核藥物，但在臨床應(yīng)用中易造成藥物性肝損害，引起轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素的升高。在其相關(guān)的機制研究中發(fā)現(xiàn)，利福平能夠抑制OATP1B1的活性，這很可能是利福平導(dǎo)致毒副反應(yīng)發(fā)生的重要原因之一。而另外一方面，OATP1B1基因的某些差異性表達(如SNP)與利福平導(dǎo)致的藥物性肝損害密切相關(guān)。本實驗中，我們首先從32例中國重慶人群中篩查發(fā)現(xiàn)在OATP1B1基因的exon5388A>G，ex

4、on6521T>C位置上存在兩個SNP位點，而這兩個位點的突變可能與肝臟攝取利福平后導(dǎo)致的膽汁淤積有關(guān)，然后在此基礎(chǔ)上進一步收集臨床標本，檢測該位點的多態(tài)性，并在體外進行該位點的相關(guān)功能學(xué)研究。
　　 研究方法：
　　 1、OATP1B1 SNP位點的發(fā)掘：
　　 我們隨機選取中國重慶地區(qū)人群中的32例，以代表中國重慶地區(qū)人群基因組DNA為參考樣本進行SNP發(fā)掘，針對基因的5’側(cè)翼(轉(zhuǎn)錄起始位點前約2kb)、編碼

5、區(qū)、5’和3’非編碼區(qū)、內(nèi)含子、外顯子交界及3’側(cè)翼序列設(shè)計引物。擴增出15個外顯子區(qū)域以及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)，PCR產(chǎn)物進行雙向測序，用PHASE軟件比對發(fā)現(xiàn)SNP位點，并構(gòu)建單倍型。
　　 2、在利福平所致肝損害患者中對OATP1B1的SNP位點進行分型：
　　 我們首先篩選出2個非同義突變位點(388A>G、521T>C)，二者可能與中國重慶地區(qū)人群中的藥物性肝損害相關(guān)。然后在樣本人群中進行病例對照研究，收集利福

6、平導(dǎo)致肝損害的患者的血標本，用Taqman基因分型技術(shù)對上述相關(guān)SNP位點進行分型，并用logistic回歸分析，評估這兩個位點構(gòu)成的單倍型在利福平所致肝損害中是否有差異，并與未發(fā)生肝損害的患者進行對照比較。
　　 3、OATP1B1的SNP進行體外研究：
　　 388A>G、521T>C兩個位點組成了4種單倍型，我們在體外分別構(gòu)建這4種單倍型的表達系統(tǒng)，對這四種單倍型的細胞模型進行體外底物攝取的功能研究。
　　

7、 結(jié)果：
　　 1、OATP1B1外顯子以及內(nèi)顯子與外顯子交界區(qū)域存在24個SNP位點，覆蓋長度為9126bp。位于外顯子上的突變有4個，其中2個為非同義突變(388A>G、521T>C)。這兩個非同義突變構(gòu)成4種單倍型*1a(388A521T)、*1b(388G521T)、*5(388A521C)、*15(388G521C)。
　　 2、在我們所檢測的人群中，所測的4種單倍型的頻率分別為：*1a23.44%、*1b66

8、.30%、*50.73%、*159.52%。在利福平所致的肝損害患者中，521T>C位點的突變在利福平所致的肝損害患者中發(fā)生風(fēng)險較高，該位點的突變與利福平所致的肝損害有明顯的相關(guān)性。在單倍型分析中，*15單倍型在利福平所致的肝損害患者中發(fā)生頻率較高，特別是與膽汁淤積型肝損害有明顯的相關(guān)性。
　　 3、體外功能研究表明，*1a、*1b、*5、*15四種單倍型在對膽酸的攝取能力方面無明顯差異，但當在利福平存在的情況下，利福平顯著抑制

9、*5、*15單倍型對膽酸的攝取。
　　 結(jié)論：
　　 本研究在對中國重慶地區(qū)人群OATP1B1的SNP篩查基礎(chǔ)上，發(fā)掘出2個外顯子的非同義突變位點，其可能與中國重慶地區(qū)人群中利福平導(dǎo)致的肝損害相關(guān)。大樣本病例對照研究結(jié)果表明，通過logistical回歸分析OATP1B1的521T>C突變位點及由該位點組成的*15單倍型與利福平所致的肝損傷有明顯相關(guān)性，在膽汁淤積型肝損傷中，*15單倍型的頻率發(fā)生較高。在初步的功能研究表