‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyDFR和PyANS的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、“蘋果梨”原產(chǎn)于延邊，是世界上最抗寒的、罕見大果的、能夠著紅色的優(yōu)良梨品種。為進(jìn)一步從分子水平上研究‘蘋果梨’果實(shí)著色的生理機(jī)制，培育具有自然著色功能的‘蘋果梨’紅色新品種（系）提供理論依據(jù)，本試驗(yàn)以‘蘋果梨’果皮為試材，采用同源克隆技術(shù)分離得到了果皮花色素苷合成途徑中二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol4-reductase，DFR）和花色素合成酶（anthocyanindin synthase，ANS）基因的全長(zhǎng) c

2、DNA序列，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；另以未套袋果實(shí)為對(duì)照，利用紫外分光光度法測(cè)定了果實(shí)著色過程中不同取樣時(shí)期的果皮內(nèi)花色素苷的含量，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)目的基因在相應(yīng)時(shí)期果皮中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴根據(jù)物種水平上DFR和ANS的保守序列設(shè)計(jì)特異引物，RT-PCR擴(kuò)增獲得‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因DFR和ANS的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為PyDFR和PyANS，GenBank登錄

3、號(hào)分別為KM588896和KM588895。序列分析結(jié)果顯示，兩基因 cDNA全長(zhǎng)分別為1039bp和1075bp，其ORF分別編碼281個(gè)和358個(gè)氨基酸，相應(yīng)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為32KDa和40KDa，理論等電點(diǎn)pI為6.32和5.38。⑵利用NCBI網(wǎng)站的Blastn和Blastp工具分別對(duì)所得序列進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)，PyDFR和PyANS與砂梨、西洋梨、蘋果等梨屬和蘋果屬植物的相應(yīng)基因均具有較高的相似性；利用 MEGA6軟件構(gòu)建的系

4、統(tǒng)進(jìn)化聚類結(jié)果顯示：PyDFR和PyANS氨基酸序列均與砂梨、西洋梨、蘋果等薔薇科植物聚為一類，說明其親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步證實(shí)已成功克隆得到‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyDFR和PyANS。⑶應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)‘蘋果梨’果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyDFR和PyANS在不同處理的不同取樣時(shí)期果皮中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：套袋‘蘋果梨’果實(shí)解袋著色過程中PyDFR和PyANS的表達(dá)水平與花色素苷含量變化關(guān)系密切，