鈣池操縱鈣離子通道在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載及相關(guān)肝細(xì)胞損傷中作用的研究.pdf

1、酒精濫用一直是西方國家導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟疾病的首要因素，在我國，隨著人群中嗜酒者比例的不斷增長，酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因。酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)具體發(fā)病機制仍未完全清楚，目前認(rèn)為ALD是在個體遺傳易感性基礎(chǔ)上，乙醇通過本身或其代謝產(chǎn)物乙醛的直接毒性、氧化應(yīng)激、免疫介導(dǎo)、細(xì)胞因子與內(nèi)毒素以及病毒疊加等機制引起肝細(xì)胞損傷。
　　 我們前期通過建立慢性酒精性肝病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)慢

2、性酒精給予可引起大鼠原代肝細(xì)胞游離鈣離子濃度(cytoplasmicfreeCa2+concentration，[Ca2+]i)顯著增加，線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondriapermeabilitytransitionpore，MPTP）持續(xù)開放、跨膜電位Δψm下降，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷和/或凋亡，提示肝細(xì)胞鈣超載是乙醇誘導(dǎo)肝臟損傷的重要途徑。乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞[Ca2+]cyt升高的機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)乙醇可以通過抑制1，4，5-三

3、磷酸肌醇受體(Inositoltrisphosphatereceptor,IP3R)降解途徑致其表達(dá)量增高，增強激素誘導(dǎo)的Ca2+自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放;慢性乙醇給予后氧化應(yīng)激增強，細(xì)胞膜通透性增加，膜離子轉(zhuǎn)運蛋白功能紊亂，使得胞外Ca2+內(nèi)流增多;同時乙醇可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體PTP呈高導(dǎo)性持續(xù)開放，使線粒體Ca2+大量外流，加重肝細(xì)胞鈣超載。但是仍然存在以下問題尚未解決:由IP3R引起的胞質(zhì)中Ca2+升高僅是一個瞬時變化，維持細(xì)胞鈣超載的持續(xù)性

4、因素尚不清楚;乙醇誘導(dǎo)后胞膜哪些離子轉(zhuǎn)運蛋白功能紊亂介導(dǎo)了胞外Ca2+內(nèi)流仍不能確定;很多研究表明胞內(nèi)[Ca2+]cyt持續(xù)升高所致的線粒體Ca2+代償性蓄積，是線粒體PTP高導(dǎo)性開放的重要原因，但前期胞內(nèi)[Ca2+]i升高的途徑仍未明確。鈣池操縱的Ca2+通道(store-operatedCa2+channels，SOCs)是包括肝細(xì)胞在內(nèi)的非興奮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的主要通道，在Ca2+參與的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動中

5、發(fā)揮著不可替代的作用。肝細(xì)胞中只有一種高Ca2+選擇性SOC，被ER內(nèi)腔Ca2+濃度降低激活而開放，生理作用在于補充ER的Ca2+而避免鈣庫Ca2+耗竭。間質(zhì)相互作用因子1(stromalinteractionmolecule1，STIM1)及鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Calciumrelease-activatedcalciumchannelprotein1，Oria1)是目前已確定的肝細(xì)胞SOCs組成蛋白，STIM1為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃

6、度感受器，Orai1是SOCs在細(xì)胞膜上的孔蛋白。
　　 基于乙醇引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+的實驗觀察及SOCs由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+濃度下降激活的生物學(xué)特性，本研究提出以下假設(shè):SOCs可能參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載病理過程，其作用可能是在乙醇誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+瞬時釋放后，維持肝細(xì)胞胞外Ca2+持續(xù)內(nèi)流，從而使胞內(nèi)Ca2+濃度達(dá)到細(xì)胞損傷的程度。本研究通過建立體外乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞慢性損傷模型及體內(nèi)慢性ALD大鼠模型，利用通道阻斷劑鑒

7、定SOCs在乙醇誘導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流及相關(guān)損傷中可能發(fā)揮的作用;檢測乙醇刺激對體內(nèi)外肝細(xì)胞SOCs通道蛋白分子STIM1、Orai1表達(dá)量及定位的影響，并檢測SOCs通道蛋白STIM1、Orai1RNA干擾對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞[Ca2+]i增高及相關(guān)損傷的影響，探討SOCs發(fā)揮作用的具體途徑。本研究分三個部分:
　　 一、鈣池操縱鈣離子通道參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷
　　 目的：
　　 觀察體外乙

8、醇慢性刺激對人HepG2細(xì)胞Ca2+濃度、細(xì)胞存活率及細(xì)胞損傷影響，通過EGTA、2-APB、La3+對上述過程的干預(yù)，分析胞外Ca2+及鈣池操縱的鈣離子通道在慢性乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷中的作用。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):人HepG2肝癌細(xì)胞株，高糖DMEM+10％胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到80-90％融合時傳代，實驗采用第4～8代細(xì)胞。
　　 2.實驗分組:實驗分為正常對照組（PBS

9、刺激），乙醇慢性刺激組（濃度梯度分別為25mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM，刺激24小時）;乙醇+EGTA處理組（EGTA濃度梯度分別為0.25mM、0.5mM、1mM），乙醇+2-APB處理組（2-APB濃度梯度分別為25μM、50μM、75μM、100μM），乙醇+La3+處理組（La3+濃度梯度分別為0.1μM、1μM、10μM）。
　　 3.肝細(xì)胞[Ca2+]cyt檢測:Fluo-3/AM或

10、Fura-2/AM標(biāo)記肝細(xì)胞Ca2+，流式細(xì)胞儀檢測平均單個肝細(xì)胞[Ca2+]cyt，光譜掃描多功能酶標(biāo)儀檢測總肝細(xì)胞[Ca2+]cyt。
　　 4.細(xì)胞存活率檢測:采用臺盼藍(lán)據(jù)染和CCK-8試劑盒兩種方法觀察乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對HepG2細(xì)胞存活的影響。
　　 5.肝細(xì)胞損傷檢測:收集各組肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，全自動生化分析儀檢測乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對ALT、AST漏出含量的

11、影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.乙醇刺激對HepG2細(xì)胞存活率及細(xì)胞損傷影響:0-800mM乙醇(刺激24h)濃度依賴性降低HepG2細(xì)胞存活率，增高細(xì)胞培養(yǎng)基上清ALT、AST漏出量。200mM乙醇刺激時HepG2細(xì)胞存活率為65.28±7.38％（臺盼藍(lán)）及67.83±4.41％(CCK8)，因此選擇200mM乙醇作為下一步的刺激實驗濃度。
　　 2.乙醇刺激對HepG2細(xì)胞Ca2+濃度的影響:0-400mM

12、乙醇濃度依賴性增高HepG2細(xì)胞胞漿游離Ca2+濃度，且光譜掃描多功能酶標(biāo)儀檢測總肝細(xì)胞[Ca2+]cyt水平高于流式細(xì)胞儀檢測的平均單個肝細(xì)胞[Ca2+]i水平。
　　 3.EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對HepG2細(xì)胞Ca2+濃度的影響:EGTA、2-APB、La3+干預(yù)濃度依賴性降低200mM乙醇刺激HepG2細(xì)胞增高的[Ca2+]i水平，三者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4.EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對H

13、epG2細(xì)胞存活率及細(xì)胞損傷影響:與200mM乙醇刺激組相比，EGTA、2-APB、La3+干預(yù)濃度依賴性增高HepG2細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞培養(yǎng)基上清ALT、AST漏出量，三者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外乙醇慢性刺激濃度依賴性增高HepG2細(xì)胞Ca2+濃度并加重細(xì)胞損傷，可作為乙醇刺激肝細(xì)胞損傷的體外研究模型。
　　 2.胞外Ca2+內(nèi)流參與乙醇慢性刺激HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高，由于EG

14、TA、2-APB、La3+三者之間的干預(yù)效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)差異，因此通過鈣池操縱的鈣離子通道的胞外Ca2+內(nèi)流可能是其中的主要成分，且鈣池操縱的鈣離子通道介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流參與乙醇所致的肝細(xì)胞損傷。
　　 3.EGTA、2-APB、La3+干預(yù)不能完全抑制乙醇所致的HepG2細(xì)胞Ca+濃度增高，因此除胞外Ca+內(nèi)流外，胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放也參與乙醇刺激所致的HepG2細(xì)胞Ca+濃度增高及細(xì)胞損傷。
　　 二、體內(nèi)外慢性乙醇

15、刺激誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣池操縱鈣離子通道分子表達(dá)增高
　　 目的:
　　 檢測體外慢性乙醇刺激對HepG2細(xì)胞鈣池操縱鈣離子通道蛋白主要組成分子STIM1及Orai1表達(dá)的影響，檢測STIM1及Orai1在慢性酒精性肝病大鼠模型肝組織中的表達(dá)、定位，分析STIM1及Orai1與肝組織損傷的關(guān)系，探討SOCs參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載及相關(guān)損傷的具體途徑。
　　 方法:
　　 1.體外實驗:人HepG2細(xì)胞株，高糖D

16、MEM+10％胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到80-90％融合時傳代，種入6孔板，細(xì)胞貼壁后進行刺激。細(xì)胞分為正常對照組（PBS刺激），乙醇慢性刺激24h組、48h組、72h組。
　　 2.體內(nèi)實驗:40只成年雄性Wistar大鼠正常飼養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組及ALD模型組。模型組橄欖油拌平衡飼料喂養(yǎng)大鼠的基礎(chǔ)上，大鼠給予每日兩次白酒胃內(nèi)灌注，白酒折算成酒精后其量及濃度每兩周遞增一次。正常對照組給予等量生理鹽水每日兩次灌胃。各組大鼠于

17、16周全部處死。取肝組織標(biāo)本，通過HE染色觀察肝臟病理學(xué)改變。
　　 3.SOCs通道蛋白分子STIM1及Orai1表達(dá)檢測:各組HepG2細(xì)胞及ALD大鼠肝組織提取總RNA及總蛋白，熒光定量-PCR和Westernblot檢測STIM1及Orai基因和蛋白表達(dá)，肝組織行免疫組化檢測STIM1及Orai1定位改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外慢性乙醇刺激對HepG2細(xì)胞SOCs通道蛋白表達(dá)的影響:與正常對照組相

18、比，200mM乙醇刺激明顯增加HepG2細(xì)胞STIM1及Orai1的基因及蛋白表達(dá)量，且其表達(dá)增加持續(xù)至少72h。
　　 2.慢性酒精性肝病大鼠造模情況:與對照組相比，模型組大鼠精神萎靡、體重增長緩慢，肝重/體重比增加，肝組織HE染色可觀察到肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、灶狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。
　　 3.慢性酒精性肝病大鼠肝組織SOCs通道蛋白表達(dá):與正常對照組相比，ALD大鼠肝組織STIM1及Orai1的基因及蛋白表達(dá)量

19、明顯增高，免疫組化顯示正常對照組見少量STIM1及Orai1陽性顆粒分布于中央靜脈及匯管區(qū)周圍，STIM1呈胞漿及胞膜表達(dá)，Orai1呈胞膜表達(dá)，ALD模型組大鼠STIM1及Orai1陽性顆粒明顯增多，分布類似，主要分布于酒精性肝損傷中易受損的肝腺泡三區(qū)，STIM1呈胞膜聚集趨勢。
　　 結(jié)論:
　　 體內(nèi)外研究均顯示慢性乙醇刺激可增加肝細(xì)胞SOCs通道蛋白STIM1與Orai1的表達(dá)，且兩者呈平行性增加，提示乙醇可能通

20、過增高SOCs通道蛋白分子表達(dá)，增加胞外鈣離子內(nèi)流而加重肝細(xì)胞損傷。
　　 三、鈣池操縱鈣離子通道蛋白RNA干擾對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷的影響
　　 目的:
　　 觀察針對SOCs通道蛋白分子STIM1及Orai1的RNA干擾對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷的影響，進一步明確STIM1及Orai1在SOCs參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載及相關(guān)損傷中各自的作用。
　　 方法:

21、>　　 1.小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)設(shè)計合成篩選:根據(jù)在Genebank中檢索的人STIM1、Orai1基因序列，利用Sofld軟件設(shè)計3對針對人STIM1、Orai1基因的siRNA序列。應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，WesternBlot驗證其對STIM1、Orai1表達(dá)抑制的有效性，挑選抑制效應(yīng)最強的siRNA進行下一步實驗。
　　 2.STIM1及Orai1的R

22、NA干擾對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷的影響:HepG2細(xì)胞，分別設(shè)立乙醇誘導(dǎo)組、干擾對照組、STIM1干擾組、Orai1干擾組及STIM1/Orai1共同干擾組，按照第一部分的方法進行肝細(xì)胞[Ca2+]cyt檢測、細(xì)胞存活率檢測及肝細(xì)胞損傷檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.STIM1、Orai1SiRNA篩選:篩選出針對人STIM1、Orai1的siRNA序列各一條，WesternBlot驗證可有效抑制ST

23、IM1、Orai1蛋白表達(dá)，抑制效率在60-70％。
　　 2.STIM1及Orai1的RNA干擾對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高的影響:針對STIM1及STIM1/Orai1的RNA干擾可有效降低乙醇引起的HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高，且Si-STIM1/Orai1組略低于Si-STIM1組，但單獨針對Orai1的RNA干擾不能有效降低乙醇引起的HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高。
　　 3.STIM1及Orai1的RN

24、A干擾對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響:針對STIM1及STIM1/Orai1的RNA干擾可有效增高200mM乙醇刺激后HepG2的細(xì)胞存活率，降低200mM乙醇刺激后HepG2培養(yǎng)上清中ALT、AST的含量，但單獨針對Orai1的RNA干擾無顯著作用。
　　 結(jié)論:
　　 慢性乙醇刺激可能主要通過增高STIM1表達(dá)，增加SOCs通道開放的頻率，使胞外鈣離子內(nèi)流增多，從而加重肝細(xì)胞損傷，同時乙醇刺激肝細(xì)胞Orai1表達(dá)增多，使