鐵催化酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷機(jī)理的研究.pdf

1、鐵是生物體內(nèi)重要的微量元素，參與細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化。但是鐵在體內(nèi)的大量聚積，可以誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)活性氧水平的上升，引起生物大分子（蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)）的氧化，最終對(duì)機(jī)體造成損傷。在酒精性肝病發(fā)生的過程中，鐵有重要的作用。酒精性肝病患者的肝組織中通常存在大量鐵的聚集。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有動(dòng)物研究表明鐵對(duì)酒精引起得肝臟損傷具有正協(xié)同的作用，但是還沒有在細(xì)胞水平研究鐵對(duì)酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響。黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的多酚

2、類物質(zhì)，也是多種具有益生作用植物的有效成分。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，很多黃酮類化合物對(duì)于慢性或急性酒精刺激誘導(dǎo)的肝損傷，具有一定的治療或預(yù)防效果。但是沒有構(gòu)建出合適的鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型用于篩選治療或預(yù)防酒精性肝損傷的黃酮類化合物。
　　本文從細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)入手，首先分析了不同形態(tài)的鐵的催化氧化能力與肝細(xì)胞損傷之間的關(guān)系；然后利用從中篩選的檸檬酸鐵作為外源鐵添加劑，在HepG2細(xì)胞（在該細(xì)胞系中 CYP2E1不表達(dá)）中，研究了鐵的催化

3、氧化的作用對(duì)酒精誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的影響，以及黃酮類化合物保護(hù)作用的機(jī)理。主要結(jié)果如下：
　　（1）不同形態(tài)的鐵催化氧化的能力與肝細(xì)胞損傷之間的關(guān)系。
　　首先，在體外化學(xué)體系上研究了高鐵血紅蛋白以及三種非蛋白結(jié)合小分子鐵化合物——氯高鐵原卟啉、檸檬酸鐵和EDTA-Fe（Ⅲ）——催化氧化的能力。再以人肝癌細(xì)胞系HepG2為研究對(duì)象，采用MTT法檢測細(xì)胞活性，Annexin V/PI雙染法流式檢測細(xì)胞凋亡，免疫熒光的方法檢測細(xì)胞蛋白

4、質(zhì)硝基修飾的情況和4-HNE的水平，免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡的方法檢測α-烯醇酶的表達(dá)和硝化。結(jié)果顯示：在體外化學(xué)體系中，氯高鐵原卟啉和高鐵血紅蛋白具有較強(qiáng)的催化氧化的能力，檸檬酸鐵基本上沒有催化氧化的能力，EDTA-Fe（Ⅲ）催化氧化的能力相對(duì)較弱；在細(xì)胞水平上，氯高鐵原卟啉和EDTA-Fe（Ⅲ）可以促進(jìn)葡糖糖氧化酶（GO）/葡糖糖（G）-NaNO2體系誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的程度，氯高鐵原卟啉鐵的作用要明顯高于EDTA-Fe（Ⅲ），檸檬酸鐵和高鐵

5、血紅蛋白構(gòu)建的Fe（Ⅲ）- GO/G- NaNO2體系不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；不同鐵構(gòu)成的Fe（Ⅲ）- GO/G- NaNO2對(duì)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)和硝化、脂質(zhì)過氧化的影響不同。這表明：在體外化學(xué)體系中，含鐵化合物催化氧化的作用，主要依賴卟啉鐵的參與；在細(xì)胞體系中，含鐵化合物對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)或硝化、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡的影響和它自身催化氧化的能力沒有直接的關(guān)系。
　?。?）檸檬酸鐵促進(jìn)酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及黃芩苷的作用

6、。
　　以HepG2細(xì)胞（在該細(xì)胞系中CYP2E1不表達(dá)）為研究對(duì)象，采用MTT法檢測細(xì)胞活性、Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、免疫熒光的方法檢測細(xì)胞iNOS表達(dá)、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和4-HNE的水平、蛋白質(zhì)印跡的方法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化程度和ERK1/2磷酸化的程度、用DCFH和DMA-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的水平，研究了鐵對(duì)酒精誘導(dǎo)的氧化/硝化應(yīng)激的影響以及黃芩苷的作用。結(jié)果表明：鐵對(duì)酒精誘導(dǎo)

7、的細(xì)胞內(nèi)ROS、NO、蛋白質(zhì)羰基化、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和脂質(zhì)過氧化水平的上升具有促進(jìn)的作用；鐵和酒精的共同作用還可以改變iNOS在細(xì)胞的分布；鐵增加了酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的程度；在酒精-鐵模型中，抑制iNOS的活性可以增加細(xì)胞死亡的數(shù)量；鐵和酒精可以增加ERK1/2的磷酸化水平，酒精抑制了ERK1/2磷酸化的水平；黃芩苷可以通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS、NO、蛋白質(zhì)羰基化、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和脂質(zhì)過氧化的水平，阻斷鐵和酒精引起的iNOS在細(xì)胞內(nèi)分布的

8、變化，減低ERK1/2磷酸化的程度，從而減少了細(xì)胞凋亡的程度；iNOS活性的抑制可以增強(qiáng)鐵和酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的程度。這說明：雖然在酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的過程中CYP2E1發(fā)揮了重要的作用，但是在CYP2E1不表達(dá)的肝細(xì)胞中外源鐵可以促進(jìn)酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激；參與調(diào)控酒精和鐵誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路是不一樣的；在鐵-酒精細(xì)胞模型中，NO可能是一種信號(hào)分子，具有保護(hù)細(xì)胞的作用。
　　（3）研究鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型中黃酮類

9、化合物護(hù)肝作用的機(jī)理
　　采用MTT法檢測細(xì)胞活性，ABTS法檢測黃酮類化合物的抗氧化作用，并利用PI單染活細(xì)胞檢測檢測死亡細(xì)胞的數(shù)目，最后利用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子的水平，綜合研究了在鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型中，黃酮類物質(zhì)保護(hù)肝細(xì)胞的作用與它的抗氧化性和鐵結(jié)合能力之間的關(guān)系。結(jié)果表明：在鐵-酒精肝細(xì)胞損傷模型中黃酮類化合物的保護(hù)作用主要和它的鐵結(jié)合能力有關(guān)，但并不是具有鐵結(jié)合能力的黃酮類化合物都會(huì)在這個(gè)細(xì)胞模型中發(fā)揮保護(hù)肝