載缺氧誘導(dǎo)因子-1α短發(fā)卡式小干擾RNA質(zhì)粒的聚乳酸聚乙醇酸共聚物納米粒對激光誘導(dǎo)大鼠脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用.pdf

1、研究背景：年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是發(fā)達(dá)國家50歲以上人群的主要致盲性眼病，而脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是導(dǎo)致嚴(yán)重視力喪失的主要原因。目前的治療方法，如經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?TTT)、光動力學(xué)療法(PDT)，或者玻璃體內(nèi)注射曲安耐德(TA)，雖然可以通過部分地下調(diào)多種血管發(fā)生因子的表達(dá)而發(fā)揮抑制CNV的作用，但存在顯著的副作用，如全層視網(wǎng)膜損壞、中心視力喪失以及有限的應(yīng)用指征和治療后的高復(fù)發(fā)率。隨著CNV的發(fā)病機(jī)理逐漸被闡明，目前的研究證實(shí)

2、抗新生血管療法可能更有利于CNV的治療?；谵卓寡苌L因子(VEGF)或VEGF受體(VEGFR)這一原理，出現(xiàn)了新型的治療方法如玻璃體腔注射bevacizumab(avastin)、ranibizumab(Lucentis)或pegaptanib(Macugen)。但此療法仍然存在潛在的不足之處，有證據(jù)顯示，單獨(dú)抑制VEGF不足以有效抑制CNV。
　　臨床研究證實(shí)，Bruch膜的年齡相關(guān)性改變可導(dǎo)致外層視網(wǎng)膜缺氧，通過刺激視網(wǎng)

3、膜色素上皮(RPE)細(xì)胞的VEGF過表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CNV形成。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是缺氧活化的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)、氧輸送及腫瘤細(xì)胞的缺氧適應(yīng)方面具有重要作用。作為哺乳動物對低氧壓反應(yīng)的主控開關(guān)，HIF-1在缺氧條件下調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，包括VEGF、紅細(xì)胞生成素(EPO)、和血小板衍生生長因子(PDGF)等。在CNV發(fā)生發(fā)展的過程中，這些基因共同發(fā)揮關(guān)鍵的作用。HIF-1由α亞基和β亞基組成。HIF-1β在常氧及缺氧狀態(tài)下均

4、穩(wěn)定存在，而HIF-1α表達(dá)及活性受缺氧誘導(dǎo)，下調(diào)缺氧狀態(tài)下HIF-1α的表達(dá)可抑制HIF-1的形成，從而降低其對VEGF的轉(zhuǎn)錄激活，因此，HIF-1α有可能成為基因治療眼內(nèi)新生血管疾病的靶點(diǎn)。阻斷某種主控開關(guān)分子如HIF-1，不僅下調(diào)VEGF表達(dá)，同時(shí)協(xié)調(diào)多種其他非確定因子以獲得協(xié)同效應(yīng)，因而此治療策略逐漸成為人們關(guān)注的研究熱點(diǎn)。
　　基因治療是指把基因?qū)肴梭w細(xì)胞，使其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，從而達(dá)到治療疾病目的的技術(shù)方法。眼部因位置

5、淺表，易于基因?qū)胫委熀陀^察，以及血-眼屏障的存在，是基因治療的理想靶器官。已有研究證實(shí)，針對HIF-1α的小干擾RNA(siRNA)可抑制人RPE細(xì)胞的VEGF表達(dá)。在動物模型上應(yīng)用針對VEGF或VEGFR的siRNA同樣獲得不同程度的抑制效果。通過玻璃體腔注射，靶向VEGF或VEGFR的RNA干擾(RNAi)的臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢陂_展?？墒?，基因治療存在的最大問題是在維持轉(zhuǎn)入基因的高水平表達(dá)。siRNA等基因類物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)迅速被降解，因

6、此只能短暫的抑制新生血管進(jìn)程從而導(dǎo)致新生血管復(fù)發(fā)。為了獲得眼內(nèi)的長期基因表達(dá)或藥效，必須在較長的一段時(shí)期內(nèi)反復(fù)給予玻璃體腔注射，可能導(dǎo)致某些眼部并發(fā)癥，如玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離或眼內(nèi)炎。因此，為了達(dá)到治療效果最大化和最小的副作用，合理的藥物遞送系統(tǒng)(DDS)成為眼部基因治療的首要考慮。
　　一個(gè)理想的釋控體系必須在一定的時(shí)間內(nèi)以持續(xù)的方式釋放包載的藥物。由聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)制得的生物降解、生物相容

7、性納米粒已廣泛應(yīng)用在藥物遞送方面。它們在體內(nèi)水解代謝，而對組織細(xì)胞沒有毒性作用。通過改變分子量、親水性和丙交酯與乙交酯之間的比率等理化特性，PLGA的降解速率可調(diào)控包載的基因物質(zhì)或藥物在細(xì)胞內(nèi)以緩慢的速率釋放。此外，包載在PLGA基質(zhì)內(nèi)的DNA片段受到納米粒的保護(hù)而免于核酸內(nèi)切酶的作用。因此，采用PLGA納米粒包載可沉默HIF-1α的基因物質(zhì)，可能為眼底新生血管疾病的基因治療提供更安全、有效的途徑。
　　目的：(1)構(gòu)建針對大鼠H

8、IF-1α的短發(fā)卡式小干擾RNA(shRNA)表達(dá)載體；(2)進(jìn)行PLGA納米粒包載并評測納米粒相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)；(3)觀察納米粒在視網(wǎng)膜內(nèi)的穿透性、眼內(nèi)分布，評價(jià)pshHIF-1α納米粒對CNV的抑制效率；(4)檢測納米粒玻璃體腔注射對視網(wǎng)膜的毒性。
　　方法：(1)針對大鼠HIF-1α特異性siRNA載體的構(gòu)建、測序及內(nèi)源篩靶：由上海吉凱基因公司提供pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA載體并代理構(gòu)建了針對大鼠NM_024

9、359基因(HIF-1α)4個(gè)靶點(diǎn)的RNAi載體并經(jīng)過酶切鑒定測序。將包裝了干擾序列的慢病毒顆粒感染大鼠小腸隱窩細(xì)胞IEC6，通過熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況，RT-PCR檢測目的基因mRNA表達(dá)情況。產(chǎn)生非靶向性的陰性對照序列的pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA載體作為本實(shí)驗(yàn)的無關(guān)序列對照。質(zhì)粒均在DH5α大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增，利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒純化，凍干。(2)載pshHIF-1α納米粒的制備及其理化性

10、質(zhì)測定：采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備載pshHIF-1αPLGA納米粒乳液，常溫?fù)]發(fā)有機(jī)溶劑，高速離心機(jī)離心、洗滌后收集沉淀，凍干。紫外分光光度計(jì)檢測納米粒的包埋效率、載藥率和體外釋放速率。通過激光粒度分析及Zeta電位分析測定載pshHIF-1α納米粒的粒度分布范圍，利用透射電鏡觀察納米粒表面形態(tài)和粒徑范圍。(3)動物模型建立及玻璃體腔給藥：健康成年棕色挪威(BN)大鼠116只，每只大鼠隨機(jī)選取1眼為實(shí)驗(yàn)眼，采用激光光凝建立CNV模型，另

11、1只眼為對照眼。隨機(jī)設(shè)立空白納米粒組、PBS組、裸質(zhì)粒組、無關(guān)序列對照組、載pshHIF-1α納米粒轉(zhuǎn)染組和單純模型組。建模成功后給予玻璃體腔內(nèi)注射，各組實(shí)驗(yàn)眼分別注入10μl空白納米粒(1.89mg/ml)、pshHIF-1α(0.02mg/ml)、無關(guān)序列shRNA質(zhì)粒納米粒(1.89mg/ml)、pshHIF-1α納米粒(1.89mg/ml)或PBS。(4)注射后3、7、14和28d過量麻醉處死大鼠，灌注后取眼球制成眼杯，行冰凍切

12、片，DAPI染核后激光共聚焦顯微鏡下觀察納米粒在眼內(nèi)的分布和視網(wǎng)膜穿透性。光凝后14d，通過熒光素眼底血管造影(FFA)觀察CNV的熒光滲漏面積；過量麻醉處死動物，通過光學(xué)顯微鏡測定CNV平均中央厚度。(5)分別于0、7和28d對PBS組、空白納米粒組、裸質(zhì)粒組和pshHIF-1α納米粒組進(jìn)行閃光視網(wǎng)膜電圖(f-ERG)檢查檢測視網(wǎng)膜功能。于激光后14d和28d，過量麻醉處死大鼠，取標(biāo)本于透射電鏡下觀察視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)改變。
　

13、　結(jié)果：(1)經(jīng)測序證實(shí)克隆的4條干擾序列100％打靶正確。熒光檢測結(jié)果顯示，靶點(diǎn)病毒的感染效率均達(dá)到70％以上。Realtime-PCR檢測結(jié)果顯示相對于陰性對照病毒感染組，KD2號和KD3號靶點(diǎn)對IEC6細(xì)胞HIF-1α基因的表達(dá)敲減效率分別達(dá)到45％和40％。選取敲減效率較高的2號質(zhì)粒進(jìn)入下部分實(shí)驗(yàn)，其序列為：5′-CCAGTTGAATCTTCAGATA-3′。
　　(2)78.7％載pshHIF-1α納米粒集中分布在164

14、nm～342nm之間，呈窄分布，平均粒度為284nm，Zeta電位為-8.91mV。透射電鏡下納米粒呈大小均勻的圓形或橢圓形粒子，直徑在100nm～300nm左右。紫外分光光度法測得納米粒包埋效率為60.2％，納米粒中基因含量為1.06％。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示載pshHIF-1α納米粒在體外最初5d為突釋相，約有60％～70％的質(zhì)粒DNA釋放；在隨后的23d呈穩(wěn)態(tài)緩釋。
　　(3)玻璃體腔內(nèi)注射后各時(shí)間點(diǎn)通過激光共聚焦對納米粒的視網(wǎng)膜

15、穿透性及轉(zhuǎn)染效率觀察顯示，注射后3d載pshHIF-1α納米粒組和無關(guān)序列對照組可見GFP在視網(wǎng)膜內(nèi)層表達(dá)，此外，睫狀體、脈絡(luò)膜和CNV局部也可見綠色熒光表達(dá)。7d可見綠色熒光蛋白表達(dá)優(yōu)先向RPE層聚集，并一直持續(xù)呈明亮的線狀表達(dá)直至注射后4周后消失。裸質(zhì)粒組在3d時(shí)可見散在熒光表達(dá)于視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜，7d時(shí)已觀察不到熒光表達(dá)，整個(gè)觀察過程中無綠色熒光在RPE層呈線狀聚集的現(xiàn)象?？瞻准{米粒組、單純模型組和PBS組始終均未觀察到熒光。

16、>　　(4)免疫熒光染色顯示3d時(shí)HIF-1α表達(dá)于CNV局部，載pshHIF-1α納米粒組和裸質(zhì)粒組HIF-1α表達(dá)較其它組明顯減少(P<0.01)。光凝后14d，F(xiàn)FA結(jié)果顯示載pshHIF-1α納米粒組較其它各組的CNV熒光素滲漏面積顯著減少(P<0.01)，光學(xué)顯微鏡測定結(jié)果顯示載pshHIF-1α納米粒注射組的CNV平均中央厚度為58.28±9.57μm(n=10)，PBS組、空白納米粒組、無關(guān)序列對照組、裸質(zhì)粒組和單純模型組

17、的CNV平均中央厚度分別為是107.86±11.29μm(n=9)、99.85±10.42μm(n=9)、104.33±11.64μm(n=8)、91.79±8.78μm(n=10)以及102.2±8.3μm(n=10)，組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　(5)玻璃腔注射后各時(shí)間點(diǎn)f-ERG檢測顯示，PBS注射組、空白納米粒組、裸質(zhì)粒組和載pshHIF-1α納米粒組等注射眼各組之間的ERG-a波與b波波幅值和峰時(shí)值相比均無

18、明顯差異(P>0.05)；而7d時(shí)各組的ERG-a波與b波波幅值和峰時(shí)值與其基線值(0d)相比均有降低和延長(P<0.01)，28d時(shí)則無明顯差異(P>0.05)。玻璃體腔注射后14d透射電子顯微鏡下觀察可見PBS組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體空泡化，膜盤結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)纖維層線粒體空泡化明顯，微管及微絲結(jié)構(gòu)紊亂。載pshHIF-1α質(zhì)粒納米粒組可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層線粒體空泡化明顯，膜盤結(jié)構(gòu)基本完整，視神經(jīng)纖維層線粒體空泡化，微管擴(kuò)張，微絲排列紊亂，神經(jīng)

19、節(jié)細(xì)胞胞漿內(nèi)及近核膜處可見納米粒，直徑約為100nm，形狀類圓形或不規(guī)則。28d時(shí)PBS組和載pshHIF-1α納米粒組均僅可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輕度空泡化，微管、微絲結(jié)構(gòu)輕度紊亂。
　　結(jié)論：針對大鼠HIF-1α的siRNA表達(dá)載體可被成功構(gòu)建，并進(jìn)一步證實(shí)應(yīng)用針對HIF-1αmRNA的RNAi技術(shù)可以抑制體內(nèi)新生血管。PLGA納米粒能延長其包載的shRNA被酶降解的時(shí)間，從而延長基因物質(zhì)在體內(nèi)的作用時(shí)間，較裸質(zhì)粒組更有效地抑制大鼠激光