Annexin5對疼痛應(yīng)激模型鼠生殖功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、膜聯(lián)蛋白(Annexin)是一種一鈣離子依賴的方式與負(fù)離子磷脂結(jié)合的蛋白家族,在從真菌到高級脊椎動物的超過65個物種中總共鑒定出160多種獨特的膜聯(lián)蛋白。其中膜聯(lián)蛋白5(annexin5,A5)是膜聯(lián)蛋白家族成員中含量最豐富的蛋白,約占細(xì)胞總蛋白的1％,其分子量約36kD。已有研究表明annexin5具有多種功能,如抗凝血、具有鈣離子通道活性、抑制磷脂酶A2和蛋白激酶C的活性,可能參與胞吞和胞吐作用等。Kawaminami等研究發(fā)現(xiàn)an

2、nexin5存在于大鼠的甲狀腺、腎上腺、卵巢、睪丸等內(nèi)分泌器官,并呈細(xì)胞特異性分布。
　　 應(yīng)激(stress)是機(jī)體對內(nèi)外環(huán)境劇變刺激作出的包括精神、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫等方面的綜合應(yīng)答狀態(tài)。由神經(jīng)損傷引起的病理性神經(jīng)疼痛是一種持續(xù)疼痛,激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸和中樞自律系統(tǒng)。大量研究表明,慢性軀體和心理應(yīng)激均能抑制或損傷雄性動物的性腺軸功能,延遲男性青春期發(fā)育,影響精子生成,甚至造成永久不育。強(qiáng)烈的身心應(yīng)激尤其

3、是長期慢性應(yīng)激嚴(yán)重影響著人類的身心健康,導(dǎo)致臨床疾病、亞健康狀態(tài)及早衰。目前認(rèn)為慢性疲勞綜合征和抑郁癥的發(fā)生均與長期應(yīng)激有關(guān)。應(yīng)激危害生殖內(nèi)分泌功能的事實,早已得到國外學(xué)者的廣泛認(rèn)同。
　　 本實驗室先前的研究發(fā)現(xiàn),慢性疼痛應(yīng)激大鼠睪丸組織中annexin5 tuRNA及蛋白水平表達(dá)均顯著降低,生殖相關(guān)參數(shù)下降,同時睪酮分泌也受到抑制；體外實驗證實,于大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞(leydig cell)培養(yǎng)液中加入annexin5能增加間

4、質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌,并且這種刺激作用具有劑量與時間依賴性。進(jìn)一步的實驗證實,ERK1/2 MAPK是annexin5調(diào)控睪酮合成的關(guān)鍵信號通路。提示annexin5可能是一種重要的生殖內(nèi)分泌調(diào)控因子。
　　 為了進(jìn)一步研究annexin5在生殖系統(tǒng)中的作用,我們建立了慢性疼痛應(yīng)激模型一坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)模型,探討annexin5在由慢性疼痛應(yīng)激造成的生殖損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制

5、。本實驗共分四大部分:第一部分,用三種不同劑量的annexin5(7.5μg/kg、15μg/kg、30μg/kg)腹腔注射正常SD大鼠以確定最適注射劑量。腹腔注射21d后,與對照組(腹腔注射等量的pH8.0 Tris-HCl)相比,15μg/kg實驗組大鼠附睪系數(shù)與精子相對計數(shù)均顯著提高(P<0.05):其它劑量組與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。7.5μg/kg組和15μg/kg組大鼠血清睪酮含量顯著高于對照組(P<0.0

6、1),30μg/kg組大鼠睪酮含量雖也有升高,但與對照組比較,結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 第二部分:建立SNI模型。實驗分為3組:正常對照組、假手術(shù)組、模型組。模型組結(jié)扎并切斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)以建立SNI模型；假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)干及其分支而不切斷神經(jīng)。對照組不做任何處理。通過檢測各組大鼠血清ACTH水平,評價模型建立情況。實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠在建模7d后血清ACTH含量顯著高于對照組和假手術(shù)組(P<0.01

7、),表明模型建立成功。
　　 第三部分:在實驗二的基礎(chǔ)上,將動物分為四組,1,實驗組:模型大鼠腹腔注射15μg/kg劑量的annexin5,連續(xù)21d。對照組分別是:2,模型對照組:模型鼠腹腔注射等量的pH8.0Tris-HCl,連續(xù)注射21d。3,假手術(shù)對照組:假手術(shù)大鼠腹腔注射等量的pH8.0 Tris-HCl,連續(xù)注射21d。4,正常對照組:正常對照組大鼠腹腔注射等量的pH8.0 Tris-HCl,連續(xù)注射21d。結(jié)果表明

8、與正常對照組相比,模型對照組睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)以及精子相對計數(shù)均顯著降低(P<0.05)；睪酮水平下降非常顯著(P<0.01)；HE染色見睪丸生精細(xì)胞與腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。假手術(shù)對照組大鼠與正常對照組比,上述指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。實驗組與模型對照組相比,精子相對計數(shù)(P<0.05)與睪酮含量(P<0.01)顯著提高,其他參數(shù)均有不同程度的恢復(fù),睪丸生精細(xì)胞與腔內(nèi)精子數(shù)量減少程度顯著恢復(fù)。
　　 第四部分:為了探討

9、annexin5對慢性疼痛應(yīng)激大鼠生殖損傷保護(hù)作用的機(jī)制,我們分別從睪酮合成相關(guān)蛋白和酶的表達(dá)與生精細(xì)胞凋亡這兩個方面進(jìn)行研究。首先運用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(western blotting)方法檢測annexin5對睪酮合成相關(guān)蛋白和酶在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論在mRNA水平還是蛋白水平上,與正常對照組相比,模型對照組大鼠睪丸組織膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)與3β-羥類固醇脫氫

10、酶(3β-HSD)表達(dá)均顯著下降(P<0.01)；假手術(shù)對照組大鼠P450scc與3β-HSD表達(dá)較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型對照組相比,實驗組P450scc與3β-HSD表達(dá)均顯著增加(P<0.01)。而類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的表達(dá)均無顯著差異(P>0.05)。接著,運用TUNEL法檢測生精細(xì)胞凋亡并觀察了與凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2以及Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型對照組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常對

11、照組顯著提高(P<0.01),Bax與Caspase-3的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01),Bcl-2的表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與模型對照組相比,實驗組大鼠Bax與Caspase-3表達(dá)下降(P<0.01),Bcl-2表達(dá)上升(P<0.01),導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.01),但與正常對照組相比仍有明顯差異(P<0.05)。假手術(shù)對照組大鼠的各項指標(biāo)與正常對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。
　　 由此我們