欖香烯和恩度對(duì)原發(fā)性肝癌細(xì)胞的凋亡和增殖的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌是肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差的特點(diǎn),手術(shù)切除是治療肝癌最有效的療法;但5年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)有60~70％。根據(jù)最新統(tǒng)計(jì),全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬(wàn),居惡性腫瘤的第五位。原發(fā)性肝癌按細(xì)胞分型可分為肝細(xì)胞型肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌及混合型肝癌。
　　欖香烯脂質(zhì)體注射液是從姜科植物溫郁金中提取的抗癌有效成分。其主要生物學(xué)活性為降低腫瘤細(xì)胞有絲分裂能力,誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。該藥

2、還能直接作用于細(xì)胞膜,使腫瘤細(xì)胞破裂,可以改變和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性,誘發(fā)和促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
　　恩度(endostatin)主要成分為重組人血管內(nèi)皮抑制素,為國(guó)家一類新藥,作用于新生血管內(nèi)皮細(xì)并抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移,抑制腫瘤新生血管形成,阻斷腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),加速癌細(xì)胞凋亡過(guò)程。
　　目的:探討欖香烯和恩度對(duì)于肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。
　　方法:1.噻唑藍(lán)還原法(MTT法)觀察欖香烯和恩度對(duì)HepG2

3、細(xì)胞活性的影響:分組為欖香烯20μl/ml、40μl/ml、60μl/ml、恩度50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、欖香烯加恩度20μl/ml+50μl/ml、40μl/ml+100μl/ml、60μl/ml+150μl/ml,和空白對(duì)照組。分別在96孔板里培養(yǎng)24h、48h、72h.胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞,以每空1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200微升,將培養(yǎng)板適宜條件下,培養(yǎng)一天后分別加假如上述藥物

4、濃度,同時(shí)設(shè)立4個(gè)復(fù)孔和一個(gè)空白對(duì)照,之后每種濃度都分別培養(yǎng)24h、48h、72h后,每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml),繼續(xù)在孵養(yǎng)4h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入150dsmo,震蕩2分鐘,使甲臜充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,腫瘤細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組光密度值/對(duì)照組光密度值×100%,計(jì)算各組活性。2.細(xì)胞周期檢測(cè):分組為欖香烯20μl/ml、40μl/ml恩度50μl/ml、100μl/ml欖香烯聯(lián)

5、合恩度20μl/ml+50μl/ml、40ul/ml+100ul/ml。以每空1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔體積1000μl,將培養(yǎng)板放入適宜條件下,培養(yǎng)一天后分別加入上述藥物濃度,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照,分別放在6孔板里培養(yǎng)24h。之后分用胰酶消化收集,用PBS洗一遍,保留50μl的殘液,其中的細(xì)胞數(shù)目大于1×105個(gè);取細(xì)胞懸液50ul,加入到試管底部;加入100ul試劑A,與細(xì)胞懸液輕輕混勻,盡量避免產(chǎn)生氣泡,室溫孵育10mi

6、n;加入100ul試劑B于上述試管中,輕輕混勻,盡量避免產(chǎn)生氣泡,室溫孵育10min;加入150ul試劑C于上述試管中,輕輕混勻,盡量避免產(chǎn)生氣泡,室溫孵育15min;之后流式細(xì)胞儀分析。3.細(xì)胞凋亡檢測(cè):分組為欖香烯20μl/ml、40μl/ml恩度50μl/ml、100μl/ml欖香烯聯(lián)合恩度20μl/ml+50μl/ml、40μl/ml+100μl/ml。以每空1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔體積1000微升,將培養(yǎng)板放入

7、CO2孵箱,在CO2孵箱,適宜條件下,培養(yǎng)一天后分別加入上述藥物濃度,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照,分別放在6孔板里培養(yǎng)24h后終止培養(yǎng),之后分別用胰酶消化收集,用PBS洗兩遍(每一遍都離心),收集細(xì)胞,1-5×103個(gè)細(xì)胞;加入500μl的BindingBuffer懸浮細(xì)胞;加入5μlAnnexinV-FITC混勻后,加入5μlPropidiumIodide,混勻;室溫、避光、反應(yīng)15min;之后立刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488nm,發(fā)

8、射波長(zhǎng)Em=530nm.
　　結(jié)果:1.欖香烯對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,且隨著濃度和時(shí)間的增加,抑制呈增強(qiáng)作用,腫瘤細(xì)胞活性越低。濃度越高抑制作用越強(qiáng),時(shí)間越長(zhǎng)抑制越強(qiáng)。同時(shí)恩度(避光加藥)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用也是同樣隨著濃度和時(shí)間的增加,抑制呈增強(qiáng)作用,腫瘤細(xì)胞活性減低。濃度越高抑制作用越強(qiáng),時(shí)間越長(zhǎng)抑制越強(qiáng)。兩者藥物聯(lián)合使用時(shí)有協(xié)同作用。所以說(shuō)欖香烯和恩度對(duì)肝癌細(xì)胞都有明顯抑制生長(zhǎng)的作用;同時(shí)使用時(shí)作用呈協(xié)同

9、性。2.欖香烯在肝癌腫瘤細(xì)胞周期中主要作用在G1期,因?yàn)樵贕1期細(xì)胞數(shù)目最多,可以理解為欖香烯把肝癌細(xì)胞阻止在G1期;恩度在肝癌細(xì)胞周期中在G1期細(xì)胞數(shù)目最多,說(shuō)明主要作用在G2期,使肝癌細(xì)胞主要阻止在G2期。但是當(dāng)欖香烯和恩度聯(lián)合使用時(shí),G1期細(xì)胞最多,說(shuō)明兩種藥物作用使可以細(xì)胞阻止在G1期;其實(shí)也有一個(gè)方面可以說(shuō)ELE作用在腫瘤細(xì)胞的G1期,把細(xì)胞阻止在G1期,但之后的細(xì)胞數(shù)目不多,有恩度作用,G2期細(xì)胞比后面幾期數(shù)目多。3.欖香烯