鯊肝生長(zhǎng)刺激素的分離提取、生物學(xué)性質(zhì)及初步藥效學(xué)研究.pdf

1、鯊肝生長(zhǎng)刺激素(sharpHepaticStimulatorSubstancesHSS)是從鯊魚(yú)肝臟中提取的一種促細(xì)胞再生及保護(hù)肝臟物質(zhì)。本課題對(duì)幼鯊肝臟中的肝刺激物進(jìn)行了分離純化，并研究了其對(duì)肝源性細(xì)胞的促增殖作用，及對(duì)急性肝損傷、肝細(xì)胞線粒體呼吸功能和抗氧化能力等的影響。 利用改進(jìn)后的LaBrecque等[6，7]的方法，對(duì)鯊魚(yú)肝臟中的HSS進(jìn)行了部分純化。研究中發(fā)現(xiàn)，95℃加熱15分鐘能導(dǎo)致大量活性蛋白失活，而在70℃時(shí)大

2、部分活性能夠保持。所以先提取幼鯊肝臟，物理研磨后，經(jīng)過(guò)70℃加熱20分鐘，40％乙醇沉淀去除大部分雜蛋白。通過(guò)DEAE-SepharoseTMFastFlow、SephacrylS-100HR凝膠過(guò)濾，然后通過(guò)高效液相，最終獲得到sHSS，經(jīng)蛋白質(zhì)N端測(cè)序，其N端部分氨基酸序列為：S，W，N，W，S；N，V，T，V，W，比活達(dá)到2941u/mgprotein，純化倍數(shù)達(dá)到56.8， 本課題利用[3H]-TdR摻入法研究sHSS的

3、促肝細(xì)胞增殖活性，以肝源性細(xì)胞HepG2為指示細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其不但能明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖，而且sHSS濃度與HepG2細(xì)胞的刺激指數(shù)成正相關(guān)，當(dāng)sHSS濃度為160μg/mL時(shí)，其對(duì)HepG2細(xì)胞的刺激指數(shù)達(dá)到5.33。 sHSS能顯著修復(fù)CCl4、D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺(TAA)引起的小鼠和TAA引起的大鼠急性肝損傷[8～10]，治療組血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平較對(duì)照組有了明顯降

4、低。而且TAA引起的急性肝損傷大鼠的存活率由原來(lái)的不足20％提高到大約80％。模型組的肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞大面積變性、壞死，肝小葉肝細(xì)胞點(diǎn)、片狀壞死，匯管區(qū)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝組織充血，肝細(xì)胞核破裂，肝纖維化及纖維間隔形成，脂肪變性明顯，而sHSS治療組肝細(xì)胞變性、壞死普遍減輕，壞死灶明顯減少，多為散在分布，以點(diǎn)狀壞死為主，整體的細(xì)胞形態(tài)較為完整，匯管區(qū)僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝組織充血，肝細(xì)胞只有輕度脂肪

5、變性。由此說(shuō)明注射sHSS后的肝組織和肝細(xì)胞受損的程度明顯降低。 利用TAA建立大鼠肝損傷模型發(fā)現(xiàn)：預(yù)先注射sHSS能顯著抑制大鼠肝細(xì)胞線粒體以蘋(píng)果酸鹽-谷氨酸鹽和琥珀酸鹽為底物，ADP誘導(dǎo)的氧消耗、呼吸控制率(RCR)、ADP/O、氧化磷酸化率等的降低，同時(shí)也能抑制線粒體膜上NADH-細(xì)胞色素C還原酶、琥珀酸鹽-細(xì)胞色素C還原酶、細(xì)胞色素C氧化酶和ATPase等一系列酶的活性的降低，說(shuō)明sHSS能改善因TAA而受損的線粒體呼吸

6、功能。 當(dāng)肝臟受到不同程度的損傷后，肝細(xì)胞線粒體及肝細(xì)胞中代表其抗氧化能力的谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶水平均明顯降低，實(shí)驗(yàn)證明sHSS能抑制以上各種酶活性的降低。同時(shí)我們利用硫代巴比妥酸比色法(TBARS)測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化程度，因?yàn)楸?MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，所以我們以MDA的水平來(lái)表示。TAA使模型組肝臟中丙二醛含量明顯升高，說(shuō)明TAA可能使肝臟中活性氧明顯增多，同時(shí)降低了肝臟整體的抗