CCL2在白血病細胞中的生物學作用的研究.pdf

1、第一部分CCL2基因慢病毒載體的構建
　　目的：構建趨化因子配體2（chemokine(C-C motif) ligand2，CCL2）基因的慢病毒表達載體，為研究該基因對白血病細胞的生物學作用奠定基礎。
　　方法：1.利用聚合酶鏈式擴增（PCR）技術，擴增出 CCL2基因的CDS區(qū)，與pMD19載體進行連接，陽性克隆送至公司測序。2.利用基因重組技術構建慢病毒載體質粒CCL2-PLVX，利用PLVX、PLP-VSVG、pl

2、p1、plp2慢病毒質粒包裝系統(tǒng)，在293T細胞中采用磷酸鈣沉淀法包裝CCL2慢病毒后侵染THP-1細胞，提取基因組DNA為模板，PCR擴增CCL2基因。
　　結果：所獲 CCL2基因經測序與 GenBank比對序列一致。慢病毒載體質粒CCL2-PLVX經雙酶切鑒定片段大小正確。包裝的慢病毒顆粒侵染 THP-1細胞后，CCL2基因成功插入細胞基因組DNA中。
　　結論：成功構建帶有CCL2基因的慢病毒載體，為進一步研究CCL

3、2基因對白血病細胞的生物學作用奠定了實驗基礎。
　　第二部分 CCL2基因在白血病細胞中穩(wěn)定表達及其生物學功能研究
　　目的：CCL2在白血病細胞株THP-1穩(wěn)定表達后，觀察CCL2對THP-1細胞增殖、凋亡、遷移、細胞周期及細胞耐藥性的影響，初步探討CCL2基因在白血病細胞中的生物學功能。
　　方法：將實驗細胞分成三組：未轉染組，空載體轉染組以及CCL2轉染組。1.CCK-8試劑測定細胞活力，繪制生長曲線，觀察CCL

4、2對THP-1細胞增殖的影響；2.利用FCM檢測CCL2對THP-1細胞周期的影響3.用2種化療藥物(柔紅霉素、高三尖杉酯堿)作用THP-1細胞24h，CCK-8法檢測細胞活力，觀察CCL2基因對藥物敏感性的影響；4.加入100ng/ml濃度的CCL2重組蛋白，觀察CCL2對THP-1的趨化作用；利用 Transwell小室觀察三組細胞的遷移和侵襲能力。5.收集侵襲實驗中上下室的培養(yǎng)上清，Elisa檢測CCL2蛋白濃度。6.不加/加入1

5、00ng/ml濃度的CCL2重組蛋白處理THP-1細胞24h，收集細胞做遷移RT2 profiler PCR array實驗，初步探討CCL2影響遷移的機制。
　　結果：1. CCK-8法繪制生長曲線，CCL2轉染組與對照組(空載體載體轉染組及未轉染組，下同)的細胞增殖無明顯差異（P＞0.05）；2.FCM檢測三組細胞周期發(fā)現(xiàn)，CCL2的表達對細胞周期無顯著影響（P>0.05）；3.加藥結果顯示，CCL2不影響THP-1細胞對柔紅

6、霉素、及高三尖杉酯堿的藥物敏感性；4.通過遷移和侵襲實驗我們發(fā)現(xiàn)，CCL2重組蛋白可以增強THP-1細胞的遷移能力和侵襲能力；CCL2轉染組細胞的遷移能力與對照組無明顯差異(9.293±0.302 Vs9.187±0.526，p=0.77)，穿膜能力明顯低于對照組（1.702±0.537 Vs0.520±0.255，p=0.026）；5.侵襲實驗中，轉染CCL2組上室CCL2蛋白濃度顯著高于下室（p<0.001）；6.遷移RT2 pro

7、filer PCR array顯示，CCL2重組蛋白處理THP-1細胞后，與對照組相比，EPX、SPP1、CCL2、CX3CL1和CXCL13的表達上調。
　　結論：。1.CCL2定向趨化 THP-1細胞的遷移，高表達 CCL2的細胞通過自分泌樣作用使其侵襲能力減弱；2.CCL2的表達對THP-1細胞的增殖、周期及藥物敏感性無顯著影響
　　第三部分 CCL2干擾對白血病細胞的生物學影響
　　目的：干擾CCL2在白血病細

8、胞株HL-60的表達后，觀察 CCL2基因對HL-60細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響及相關機制研究。
　　方法：1.利用慢病毒包裝的方法將干擾效率最高的RNA鏈侵染白血病細胞株HL-60，驗證CCL2基因在RNA水平和蛋白水平的表達。2.將實驗細胞分成三組：未轉染組，空載體轉染組以及sh-CCL2轉染組，使用CCK-8試劑盒測定三組細胞活力，繪制細胞生長曲線，觀察 sh-CCL2對 HL-60細胞增殖的影響；2.通過 FCM分析s

9、h-CCL2對HL-60細胞周期的影響；3.利用表達譜測序技術，分析CCL2基因穩(wěn)定沉默對HL-60細胞基因表達譜的影響。
　　結果:1.RT-PCR和Western Blot驗證CCL2表達水平成功下調。2. CCK-8法繪制生長曲線，sh-CCL2轉染組的增殖速度明顯低于對照組(空載體載體轉染組及未轉染組，下同)(p<0.01)；2.我們采用 FCM檢測三組細胞周期發(fā)現(xiàn)，sh-CCL2沉默后細胞S期含量減少12％，G1期含量增

10、加；3.測序結果顯示，CCL2穩(wěn)定沉默細胞與對照細胞間的差異表達基因共有159個，其中表達上調的基因58個，表達下調的基因101個，涉及細胞周期、TNF信號轉導、NOD樣受體信號轉導、NF-κB信號通路等多個方面，RT-PCR和Western Blot驗證CCL2沉默后，細胞內Cyclin D1的表達明顯下調。
　　結論：1. RNAi沉默CCL2后，白血病細胞HL-60增殖速度明顯減慢；2.RNAi沉默CCL2干擾HL-60細胞

11、由G1期進入S期，細胞內cyclinD1的mRNA水平和蛋白水平表達下降。
　　第四部分 CCL2/CCR2基因在急性白血病中的表達及其臨床意義
　　目的:探討CCL2/CCR2基因在急性白血病(acute leukemia，AL)患者原代骨髓細胞中的表達情況及其與AL各項臨床特征的相關性及預后意義。
　　方法:病例來源于2012-2013年期間在蘇州大學附屬兒童醫(yī)院診斷和治療的急性白血病患者176例(初診ALL66例

12、，ALL緩解60例，初診AML32例，AML緩解18例)，20例同期非急性白血病作為對照。采用患者的骨髓標本分離單個核細胞提取總RNA，逆轉錄成cDNA，利用實時熒光定量RT-PCR方法檢測CCL2和CCR2基因的轉錄水平，結合臨床資料，分析其在AL中的表達及其與臨床的相關性。
　　結果:1.CCL2及CCR2在疾病的不同病程階段表達水平不同。在ALL中，CCL2和 CCR2的表達趨勢一致，即初診組低水平，完全緩解后表達增高至正常

13、水平（PCCL2<0.001，PCCR2<0.001）。在AML中，初診組 CCL2的表達水平低于對照組（P<0.001），化療后CCL2的表達水平無改變（P=0.462）；CCR2在AML患者的表達水平與對照組無明顯差異（P>0.05）。2.初診AML患者CCL2和CCR2的表達水平高于初診 ALL患者（PCCL2=0.002，PCCR2<0.001）；3.CCL2的表達水平高低與 AL患者臨床特征及早期治療反應均無明顯相關性。