PML(NLS-)基因?qū)Π籽〖?xì)胞HL-60的生物學(xué)功能影響.pdf

1、第一部分、重組腺病毒Ad-PML(NLS-)的構(gòu)建及其鑒定
　　目的：構(gòu)建攜帶PML(NLS-)的腺病毒并觀察其對K562細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：以質(zhì)粒pCMV-HA-PML(NLS-)為模板，PCR擴(kuò)增PML(NLS-)，將產(chǎn)物連接到穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4，構(gòu)建成重組穿梭載體pAdTrace-TO4-PML(NLS-);經(jīng)PmeⅠ酶切，轉(zhuǎn)化入BJ5183感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒，獲得同源重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PM

2、L(NLS-);經(jīng)PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)染入AD293細(xì)胞，獲得重組腺病毒Ad-PML(NLS-)。用RT-PCR法和Western blotting法檢測外源PML(NLS-)在各組AD293細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá);將腺病毒感染K562細(xì)胞，并用MTT法觀察其對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果：經(jīng)過酶切、PCR和測序鑒定，重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PML(NLS-)構(gòu)建成功;在AD293細(xì)胞中成功包裝并擴(kuò)增腺病毒，滴度可達(dá)1×1010p

3、fu/ml; RT-PCR法和Westernblotting法結(jié)果顯示，Ad-PML(NLS-)攜帶的PML(NLS-)能夠在AD293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá);MTT結(jié)果表明，與未感染組和空載病毒組相比，感染重組腺病毒Ad-PML(NLS-)的K562細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用(P＜0.05)。
　　結(jié)論：成功包裝并且擴(kuò)增重組腺病毒Ad-PML(NLS-)，并且Ad-PML(NLS-)可以促進(jìn)K562細(xì)胞的增殖水平，PML(NLS-)可能

4、扮演著促癌基因的角色。
　　第二部分、重組腺病毒Ad-PML(NLS-)對HL-60細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　目的：探討PML(NLS-)對大黃素引起的人HL-60凋亡的影響及其機(jī)制。
　　方法：將重組腺病毒Ad-PML(NLS-)和空載病毒Ad-KZ分別感染HL-60細(xì)胞。RT-PCR法和Western-blot法檢測各組細(xì)胞PML(NLS-)基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平;MTT法分析細(xì)胞增殖能力;各組感染HL-60

5、細(xì)胞經(jīng)80μmol/L大黃素處理后，F(xiàn)CM法分析細(xì)胞周期分布和凋亡率;并用RT-PCR法和Western blot法分別檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因C-MYC、BCL-2和BAX的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與正常對照組和空載病毒組比較，RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，Ad-PML(NLS-)組細(xì)胞內(nèi)的PML(NLS-)表達(dá)水平明顯增高。各組細(xì)胞經(jīng)大黃素處理后，MTT結(jié)果顯示，感染Ad-PML(NLS-)的HL

6、-60細(xì)胞增值能力明顯提高;FCM結(jié)果顯示，感染A d-PML(NLS-)的HL-60細(xì)胞處于G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.05)，且凋亡率顯著降低(P＜0.05);細(xì)胞內(nèi)BCL-2和C-MYC基因mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯增高，BAX基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均明顯下降。
　　結(jié)論：過表達(dá)PML(NLS-)基因能夠促進(jìn)HL-60細(xì)胞的增殖，可能通過上調(diào)BCL-2和C-MYC基因的表達(dá)、下調(diào)BA

7、X基因的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。
　　第三部分、干擾PML(NLS-)對HL-60細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　目的：研究干擾缺失核定位信號(hào)的PML蛋白PML(NLS-)對HL-60增殖和凋亡的影響。
　　方法：將 PML(NLS-)基因的干擾質(zhì)粒pGpu6-PML(NLS-)shRNA和陰性對照質(zhì)粒pGpu6-NC shRNA轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，并設(shè)空白組。轉(zhuǎn)染后48h，采用半定量RT-PCR法和Western blot法檢測

8、各組細(xì)胞中PML(NLS-)基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平;采用MTT法檢測HL-60細(xì)胞增殖活力;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及凋亡的變化。
　　結(jié)果：干擾組的PML(NLS-)基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)與陰性對照組和空白組相比明顯減低(P＜0.05);干擾組的HL-60細(xì)胞增殖水平與陰性對照組和空白組相比降低(P＜0.05)，以48h降低最為顯著(P＜0.01);抑制PML(NLS-)可引起HL-60細(xì)胞S期比例增高，G1和G2期細(xì)胞