中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后細胞增殖效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous Systerm,CNS)損傷后形成的膠質(zhì)瘢痕是CNS再生失敗的重要因素。既往的觀點認為，成熟的膠質(zhì)瘢痕是由細胞外成分(如Ⅳ型膠原和層粘連蛋白)和細胞成分(星形膠質(zhì)細胞、成纖維細胞、巨噬細胞)等共同構(gòu)成，其中反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細胞是主要細胞成分。少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocyteprecursor cell,OPC)是最近發(fā)現(xiàn)的CNS中除神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細

2、胞、小膠質(zhì)細胞之外的第五類細胞<'[1]>。然而目前關(guān)于OPC是否參于CNS對損傷的反應(yīng)及其意義方面的研究還較少。20世紀(jì)90年代初提出成年哺乳動物CNS存在神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cell，NSC)<'[2]，并且大量的研究證實，NSC存在于CNS的廣泛區(qū)域，這些NSC在體內(nèi)大多處于靜止?fàn)顟B(tài)，在CNS損傷等病理條件或外界信號分子的刺激下可以被激活并增殖。側(cè)腦室壁的腦室下層(subventricular zone，SVZ)和

3、海馬齒狀回的顆粒下層(subgranular zone，SGZ)，是成體哺乳動物CNS中兩個NSC富集區(qū)域。Parent等的研究證明多種腦損傷模型，可引起損傷遠隔部位海馬齒狀回和室下區(qū)NSC的增殖，并且增殖的細胞可以分化為星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元等<'[3],[4]'[5]'[6]>剛。故CNS損傷不僅可引起損傷部位膠質(zhì)細胞的活化，還可以導(dǎo)致?lián)p傷部位及遠隔部位NSCs的增殖。近年越來越多的研究顯示，成年哺乳動物NSC只有在特定信號分子存在的

4、微環(huán)境中才能分化為神經(jīng)元<'[7]>。有研究顯示，BMP4與Noggin是一對對NSC的增殖分化有重要調(diào)控作用的蛋白分子。Lim等證實BMP4與Noggin共同調(diào)控成年室下區(qū)神經(jīng)干細胞的分化，BMPs信號通過促進室下區(qū)NSC向星形膠質(zhì)細胞分化，而抑制神經(jīng)元的產(chǎn)生<'[8]>。我們的研究發(fā)現(xiàn)在成年動物海馬部位BMP4亦具有促進NSC向星形膠質(zhì)細胞方向分化的功能<'[9]>。然而BMP4與Noggin在除海馬和室下區(qū)以外的其他部位是否具有類

5、似的作用，BMP4與Noggin對CNS損傷后增殖細胞的分化有何作用，還有待進一步的研究證實。 本研究采用大鼠單側(cè)眼球摘除作為動物模型，觀察損傷后不同時間點對側(cè)上丘GFAP、NG2陽性細胞的表達變化，證實單側(cè)眼球摘除后確實存在腦內(nèi)其投射部位對側(cè)上丘的損傷并闡明GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞、NG2陽性的OPC~曾殖的意義。第二部分采用．BrdU標(biāo)記的方法，觀察單側(cè)眼球摘除后損傷部位、海馬齒狀回和室下區(qū)BrdU陽性細胞的增殖，結(jié)合Br

6、dU/GFAP、BrdU/DCX免疫熒光雙標(biāo)，探討增殖陽性細胞的分化方向。最后一部分為進一步探討影響CNS損傷后損傷部位增殖細胞分化的因素，采用原位雜交和Western-blot檢測損傷后不同時間點對側(cè)上丘B(yǎng)MP4 mRNA與NogginmRNA的表達變化及Noggin蛋白的表達變化。 主要結(jié)果： 1．單側(cè)眼球摘除后24h對側(cè)上丘GFAP染色較正常對照組增加，術(shù)后24h時到1w這種表現(xiàn)進行性增加，至1w時上丘的GFAP陽

7、性細胞數(shù)量達到頂峰，染色加深，突起增多增長。但術(shù)后1w到3w之間，GFAP染色并不進～步增加。 2．單側(cè)眼球摘除后24h對側(cè)上丘NG2染色加深，損傷后1w NG2陽性細胞數(shù)量達高峰，1w至3w之間NG2陽性細胞數(shù)量緩慢減少。 3．采用BrdU標(biāo)記的方法，我們發(fā)現(xiàn)單側(cè)眼球摘除后24h視神經(jīng)的投射部位對側(cè)上丘除血管內(nèi)皮細胞外出現(xiàn)少量BrdU陽性細胞，1w時陽性細胞數(shù)量達高峰；損傷后2w時陽性細胞數(shù)量較1w時減少，3w時Brd

8、U陽性細胞進一步減少。 4．單側(cè)眼球摘除后24h雙側(cè)海馬齒狀回和室下區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)量與對照組相比輕度升高，1w時BrdU陽性細胞數(shù)量達到高峰，2w至3w之間BrdU陽性細胞數(shù)量逐漸減少。除此之外我們還觀察到，損傷后2w時，側(cè)腦室背外側(cè)角內(nèi)陽性細胞數(shù)量增加，向外延伸的距離也明顯增加；胼胝體內(nèi)BrdU陽性細胞數(shù)量增多。 5．單側(cè)眼球摘除后1w雙側(cè)海馬齒狀回和室下區(qū)DCX陽性細胞與對照組比較明顯增多，隨后的兩周陽性細胞數(shù)

9、量減少，3w時降至正常對照組水平。 6．免疫熒光雙標(biāo)顯示：對側(cè)上丘增殖的BrdU陽性細胞中可檢測到少量BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細胞，無BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細胞。海馬齒狀回和室下區(qū)增殖的BrdU陽性細胞存在BrdU/GFAP陽雙標(biāo)性細胞和BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細胞。 7．BMP4 mRNA原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，單側(cè)眼球摘除后24h對側(cè)上丘B(yǎng)MP4 mRNA陽性細胞數(shù)量較正常對照組明顯增升高，染色加深，1w組BMP4mR

10、NA的表達與24h組相比已開始降低，2w、3w組BMP4mRNA陽性細胞數(shù)量進一步減少，3w時降至正常水平。 8．各組對側(cè)上丘Noggin mRNA的表達無明顯差異，1w、2w、3w組與正常對照組相比均無明顯變化，Western-blot實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Noggin蛋白的表達在各組無明顯差異。 主要結(jié)論： 1．我們觀察到單側(cè)眼球摘除后對側(cè)上丘GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生、NG2陽性的OPC活化，證實單側(cè)眼

11、球摘除后對側(cè)上丘確實存在損傷反應(yīng)，建立了一個新的、簡便可行的CNS損傷的動物模型；同時證實除星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生外，CNS對損傷的反應(yīng)還包括NG2陽性的OPC活化。 2．CNS損傷不僅可以引起損傷局部包括星形膠質(zhì)細胞和OPC在內(nèi)的膠質(zhì)細胞反應(yīng)，還可以誘導(dǎo)損傷局部出現(xiàn)BrdU陽性細胞，海馬齒狀回和室下區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)量增加，這些部位增殖的BrdU陽性細胞中存在星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元前體細胞。 3．CNS損傷后BMP4與