逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的白細(xì)胞介素23對小鼠乳腺癌抑瘤作用的免疫機制研究.pdf

1、目的：將鼠IL-23(mIL-23)基因轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞(MA-891)，建立分泌IL-23的腫瘤細(xì)胞株(IL-23/MA-891)，研究IL-23/MA-891細(xì)胞通過分泌IL-23發(fā)揮的抗腫瘤效應(yīng)及其免疫學(xué)調(diào)節(jié)機制。 方法： 1.將攜帶mIL-23基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(LXSN/IL-23)經(jīng)ψ2和PA317細(xì)胞包裝成含mIL-23基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，再利用該病毒將mIL-23基因?qū)隡A-891細(xì)胞，經(jīng)G418篩選

2、后獲得表達(dá)mIL-23的陽性細(xì)胞克隆IL-23/MA-891。用RT-PCR法檢測IL-23/MA-891細(xì)胞IL-23基因的表達(dá)；用細(xì)胞免疫組化法檢測IL-23/MA-891細(xì)胞中IL-23蛋白的表達(dá)；用ELISA法檢測IL-23/MA-891細(xì)胞分泌mIL-23的水平及mIL-23誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的情況；用MTT比色法檢測腫瘤細(xì)胞的體外增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86分子的表達(dá)。

3、 2.將IL-23/MA-891細(xì)胞、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(LXSN/MA-891)和野生型MA-891細(xì)胞分別接種于津白Ⅱ號(TA-2)小鼠皮下，于接種腫瘤細(xì)胞后30天分別處死每組小鼠各3只，取出腫瘤組織和脾臟備用。各組其余7只小鼠用于觀察生存期和腫瘤大小。用ELISA法檢測3組小鼠脾細(xì)胞在體外經(jīng)MA-891誘導(dǎo)下，IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-4的產(chǎn)生情況。用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織中細(xì)胞表面MHCI、MHCII、CD80、CD

4、86分子的表達(dá)，檢測脾細(xì)胞CD11c陽性細(xì)胞的比率，并對脾細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞進(jìn)行檢測：用免疫組織化學(xué)技術(shù)對3組腫瘤組織中CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行檢測。 結(jié)果： 1.mIL-23轉(zhuǎn)染MA-891細(xì)胞株的建立：將攜帶mIL-23基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(LXSN/IL-23)，經(jīng)過ψ2和PA317細(xì)胞的兩次包裝，產(chǎn)生含mIL-23基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，利用該逆轉(zhuǎn)錄病毒將mIL-23基因?qū)隡A-891細(xì)胞，經(jīng)

5、G418篩選后獲得表達(dá)mIL-23的陽性細(xì)胞克隆IL-23/MA-891。經(jīng)RT-PCR和ELISA法檢測結(jié)果顯示，IL-23/MA-891細(xì)胞表達(dá)mIL-23mRNA，并分泌高水平mIL-23(136.5±2.8ng/L)，該結(jié)果證明，外源mIL-23基因已整合到MA-891細(xì)胞基因組中。 2.IL-23/MA-891細(xì)胞的生物學(xué)性狀：在Con A存在下，IL-23/MA-891細(xì)胞的培養(yǎng)上清可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ(2

6、8.5±2.7ng/L)，明顯高于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞LXSN/MA-891和野生型MA-891細(xì)胞培養(yǎng)上清作用脾細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生量(5.1±0.3 ng/L和4.7±0.6ng/L)。IL-23/MA-891細(xì)胞在體外培養(yǎng)時的細(xì)胞形態(tài)和生長速度與LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞相比無明顯差別。IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891三種細(xì)胞表面MHCI、MHCII、CD80、CD86分子的表達(dá)水平無顯著性差

7、異。 3.IL-23的體內(nèi)抗腫瘤作用：IL-23/MA-891、LXSN/MA-891及野生型MA-891細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤率均為100％，但I(xiàn)L-23/MA-891細(xì)胞在小鼠皮下的生長速度明顯慢于LXSN/MA-891及野生型MA-891細(xì)胞；接種IL-23/MA-891細(xì)胞小鼠的生存期>120天；接種LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞組小鼠腫瘤生長速度相似，平均生存期分別為50±3天和51±3天。 4.脾細(xì)胞

8、產(chǎn)生細(xì)胞因子情況：接種IL-23/MA-891細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞可產(chǎn)生較高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-12等Th1類及相關(guān)細(xì)胞因子，與接種LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞兩組小鼠相比明顯增高，而產(chǎn)生Th2類細(xì)胞因子如IL-4的水平卻無明顯差異。 5.對脾細(xì)胞中CD11c陽性細(xì)胞和CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的影響：接種IL-23/MA-891細(xì)胞組小鼠的脾細(xì)胞中，CD11c陽性細(xì)胞比率(21.4±1.6％)，與接種

9、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞組小鼠相比(12.4±1.0％和11.6±0.6％)顯著增高；接種IL-23/MA-891細(xì)胞組小鼠脾細(xì)胞中CD4+及CD8+T細(xì)胞比率(34.0±1.7％，14.6±0.6％)均較接種LXSN/MA-891細(xì)胞(12.3±0.8％，9.1±0.5％)和MA-891細(xì)胞(12.5±0.7％，9.0±0.6％)組小鼠顯著增高。 6.腫瘤組織中CD4+、CD8+T細(xì)胞的浸潤：免疫組化分析結(jié)果顯

10、示，接種IL-23/MA-891細(xì)胞小鼠的腫瘤組織中，CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤程度較接種LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞小鼠有明顯增加。 7.腫瘤組織中細(xì)胞表面分子表達(dá)的變化：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與接種LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞組相比，接種IL-23/MA-891組小鼠腫瘤組織細(xì)胞表面MHCI、MHCII、CD80、CD86分子表達(dá)水平顯著提高。 結(jié)論：mIL-23基因?qū)隡A-891細(xì)胞

11、所構(gòu)建的IL-23/MA-891細(xì)胞能夠分泌高水平mIL-23，外源性IL-23基因的插入對MA-891細(xì)胞的體外生長及生物學(xué)性狀均無明顯影響。IL-23/MA-891細(xì)胞的培養(yǎng)上清可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌較高水平IFN-γ，具有明顯的生物學(xué)活性。轉(zhuǎn)染IL-23基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞所分泌的IL-23在小鼠體內(nèi)發(fā)揮了明顯的抗腫瘤作用。增加了腫瘤組織中CD4+、CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量，促進(jìn)了小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α和IL-12等T