血小板生成素受體（Mp1）胞外區(qū)與XP1的相互作用.pdf

1、　　本課題進(jìn)行了以下工作：1.GST-Mpl-EC融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。PCR法擴(kuò)增Mpl-ECcDNA，將其構(gòu)建到已經(jīng)連有GST標(biāo)記的原核表達(dá)載體pET-28b質(zhì)粒中，與GST基因構(gòu)成融合基因，并保持靶基因的閱讀框不變。PCR及酶切鑒定正確，而且DNA測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中多肽cDNA堿基序列和閱讀框均正確，重組質(zhì)粒成功。2.GST-Mpl-EC融合蛋白的原核表達(dá)。將重組質(zhì)粒pET28b-GST-Mpl-EC轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL

2、-21中，在室溫下IPTG誘導(dǎo)4h，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有可溶的GST-Mpl-EC融合蛋白表達(dá)，分子量約為90kDa，再依此條件大量誘導(dǎo)表達(dá)，并將可溶蛋白用谷胱甘肽-瓊脂糖樹(shù)脂進(jìn)行免疫親和純化，得到可溶的純度較高的GST-Mpl-EC融合蛋白。3.XP1及其缺失突變體原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)利用PCR和DNA重組技術(shù)，對(duì)XP1進(jìn)行了N-端、C-端和中央?yún)^(qū)的缺失突變，并連同全長(zhǎng)的XP1，分別構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-28b

3、質(zhì)粒中，在大腸桿菌中表達(dá)。4.Mpl-EC及其缺失突變體原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)將Mpl-EC的兩個(gè)亞單元分別克隆出來(lái)，通過(guò)DNA重組技術(shù)，分別構(gòu)建到重組原核表達(dá)載體pET28b-GST質(zhì)粒中，并在大腸桿菌中表達(dá)。5.用GSTPull-down體外實(shí)驗(yàn)鑒定XP1和Mpl-EC蛋白間的相互作用將GST-Mpl-EC融合蛋白固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上，充當(dāng)誘餌蛋白，再用重組XP1或人類巨噬細(xì)胞裂解液過(guò)柱，通過(guò)蛋白間相互作用捕獲蛋白，洗脫后用S