Ouabain對(duì)大鼠心室肌起搏通道的電生理及表達(dá)的影響.pdf

1、洋地黃制劑是臨床上常用的正性肌力藥物。一般認(rèn)為鈉鉀泵是洋地黃藥理和毒性作用的必需條件。洋地黃在中毒劑量時(shí)，通過(guò)對(duì)鈉鉀泵的抑制而使胞漿內(nèi)鈣濃度的過(guò)度升高，從而引起的鈣超載使細(xì)胞膜電位的過(guò)度震蕩，后除極增加，導(dǎo)致快速性心律失常。 然而也有許多資料顯示除了鈉鉀泵之外洋地黃可能還有其他的作用位點(diǎn)，并且在洋地黃的藥理和毒性作用中起一定的作用。而且并非所有的洋地黃所致心律失常都是由后除極引起的，自律性增加機(jī)制在洋地黃的中毒引起的室性心律失常

2、中起重要作用。應(yīng)用起搏通道抑制劑zatebradine可以劑量依賴性的減少洋地黃導(dǎo)致的室性心律失常的發(fā)生。因此，推測(cè)起搏通道也可能是洋地黃的一個(gè)作用位點(diǎn)，洋地黃可能對(duì)起搏通道有影響。為了證實(shí)這個(gè)推測(cè)，本文研究了洋地黃對(duì)心室肌細(xì)胞起搏通道的電生理的影響，以及慢性洋地黃作用下的起搏通道基因表達(dá)的改變。 1.培養(yǎng)乳大鼠心室肌細(xì)胞的起搏電流特征及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其影響本研究工作以原代培養(yǎng)的乳大鼠心室肌細(xì)胞為標(biāo)本，對(duì)比了急性酶分離和培養(yǎng)的心室肌

3、細(xì)胞起搏電流的差異，探討了培養(yǎng)時(shí)間對(duì)起搏電流的影響。 研究表明：短期的培養(yǎng)就會(huì)使細(xì)胞膜電容明顯下降，培養(yǎng)1-3天細(xì)胞的膜電容為43±3pF，與急性分離細(xì)胞(56±7pF)相比下降了23％(p＜0.01=。培養(yǎng)4-6天、7-9天的細(xì)胞膜電容分別為44±3pF和45±4pF。膜電容隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸增大的趨勢(shì)，然而各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段細(xì)胞的膜電容之間均無(wú)明顯的差異(p＞0.05)。各個(gè)培養(yǎng)階段的起搏通道的反轉(zhuǎn)電位均在-32mV左右，

4、與急性分離細(xì)胞無(wú)差別。急性分離細(xì)胞的If的電流密度平均為4.18±0.60pA/pF，培養(yǎng)1-3天、4-6天和7-9天的細(xì)胞的If的平均電流密度分別為3.85±0.42、3.94±0.47和4.21±0.61pA/pF，各組細(xì)胞的電流密度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。各組細(xì)胞起搏電流的活化域值均在-65～-85mV之間，平均半最大激活膜電壓(V0.5)在-80～-90mV之間，各組之間沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。起搏電流的電生理

5、學(xué)特性未因培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯改變。因此，培養(yǎng)細(xì)胞可以代替急性分離細(xì)胞應(yīng)用于起搏電流的電生理研究。 2.Ouabain對(duì)乳大鼠心室肌細(xì)胞起搏電流的影響本實(shí)驗(yàn)研究觀察了不同濃度的ouabain對(duì)起搏電流的電生理影響。實(shí)驗(yàn)表明：1μM的ouabain即可明顯增加If的電流密度(對(duì)照組：4.0±0.41pA/pF；1μMouabain：4.76±0.48pA/pF，P＜0.01)。當(dāng)ouabain濃度增加到20μM時(shí)，心室肌細(xì)胞的電流

6、密度增大到4.94±0.51pA/pF(與1μMouabain組比P＜0.01)，當(dāng)ouabain的藥物濃度從20μM升高到40μM時(shí)，If的電流密度僅輕度增大(從4.94±0.51pA/pF增加到4.96±0.50pA/pF，P=0.053)，隨著ouabain藥物濃度的進(jìn)一步增加，If的電流密度并沒(méi)有明顯加大(80μM組為4.97±0.50pA/pF，P＞0.05)。在ouabain的作用下，起搏通道的半最大活化電位(V0.5)逐漸

7、向去極化方向改變，電導(dǎo)曲線明顯向右移，活化速度也明顯加快。沖洗后，起搏電流可以基本恢復(fù)到用藥前的水平。Ouabain可以增強(qiáng)尾電流的幅度，但不影響反轉(zhuǎn)電位。 為了了解細(xì)胞內(nèi)鈣和起搏通道激活的關(guān)系，本文去掉了電極內(nèi)液中的鈣鏊合劑EGTA，觀察在不鏊合細(xì)胞內(nèi)鈣的情況下，ouabain對(duì)起搏電流的影響。結(jié)果表明，在不鏊合細(xì)胞內(nèi)鈣的情況下，起搏電流幅度明顯加大，活化速度明顯加快，電導(dǎo)曲線向右移動(dòng)。起搏電流在鏊合細(xì)胞內(nèi)鈣時(shí)ouabain作

8、用基礎(chǔ)上被進(jìn)一步增強(qiáng)。細(xì)胞浴液中加入4mMCs+仍然可以阻斷增大的起搏電流。 3.ouabain對(duì)大鼠心室肌起搏通道基因表達(dá)的影響本研究應(yīng)用大鼠腹腔內(nèi)注射ouabain0.045mg/Kg·d連續(xù)兩周，可以成功的建立慢性洋地黃中毒的動(dòng)物模型。動(dòng)物心電圖出現(xiàn)PR間期延長(zhǎng)，頻發(fā)室性早搏，甚至室性撲動(dòng)。而血壓未升高，心臟沒(méi)有肥厚的表現(xiàn)。HCN2基因在ouabain組的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高了近1.5倍(P＜0.05)，其中以左心室表達(dá)

9、量增加的更為明顯。而ouabain組與對(duì)照組之間的HCN4基因表達(dá)量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)論如下：培養(yǎng)心室肌細(xì)胞可以代替急性分離細(xì)胞進(jìn)行起搏通道的電生理研究，但以一周之內(nèi)最合適。 Ouabain對(duì)心室肌起搏通道有劑量依賴性的激活作用，使起搏通道的活化域值向去極化方向改變，電流密度加大，電導(dǎo)曲線右移。尾電流不受影響，起搏通道對(duì)Na+、K+離子的通透性未受改變。Ouabain對(duì)起搏通道