外界環(huán)境與不同方藥對(duì)CIA大鼠證候及T細(xì)胞亞型漂移影響的比較研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種病因不明的慢性、進(jìn)展性、自身免疫性疾病。其病理特征為單核細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成，以及軟骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)對(duì)稱性疼痛、運(yùn)動(dòng)障礙、甚至關(guān)節(jié)強(qiáng)直畸形致殘，以及多臟器受累。目前RA的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，RA是由遺傳與環(huán)境因素共同作用而引起的一種自身免疫性疾病。 RA在中醫(yī)學(xué)屬痹證范疇?！氨浴弊肿钤缫娪凇饵S帝內(nèi)經(jīng)》，其病因據(jù)“風(fēng)

2、寒濕三氣雜至”及“邪之所湊，其氣必虛”的理論，為“內(nèi)外合邪”所致。張仲景秉承《內(nèi)經(jīng)》之旨，開痹證辨證論治之先河，后世醫(yī)家多遵從《內(nèi)經(jīng)》及《金匱要略》之論痹，結(jié)合各自所處歷史環(huán)境與個(gè)人臨床經(jīng)驗(yàn)，從不同角度深入對(duì)痹證病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，并立法組方遣藥，或配以針灸、導(dǎo)引等外治法，使痹證證治豐富多彩，各具特色。而治痹方藥之組成、配伍，以及方藥之寒熱溫涼等屬性，只有與痹證之“證候要素”、“病機(jī)”高度相符，該方藥才能獲得最佳療效。這即是痹證“方證相應(yīng)”

3、理論的研究?jī)?nèi)容，也是痹證臨床辨治的客觀要求。 為觀察外界環(huán)境對(duì)痹證證候的影響，驗(yàn)證痹證乃“內(nèi)外合邪”的病因?qū)W理論，并研究治痹方藥與痹證證型的相關(guān)性及該相關(guān)性的生物學(xué)內(nèi)涵，本課題以RA目前最為公認(rèn)的動(dòng)物模型，即Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型作為熱痹證大鼠模型，采用“人工氣候”試驗(yàn)箱進(jìn)行外界環(huán)境的“風(fēng)寒濕”或“風(fēng)濕熱”干預(yù)，再選用治療熱痹證的代表方劑——宣痹湯以及治療寒熱錯(cuò)雜痹證的代表方劑——桂枝芍藥知母湯進(jìn)行交叉治療干預(yù)，進(jìn)行

4、了有關(guān)痹證病因?qū)W理論以及痹證“方證相應(yīng)”理論的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。 1．實(shí)驗(yàn)用Ⅱ型膠原在Wistar大鼠誘導(dǎo)CIA模型。在二次免疫后，即從第2周開始，M(模型)組大鼠非致炎足(左足)出現(xiàn)炎性改變，其臨床體征與人RA體征相似，血清Anti-CⅡ、IgG抗體以及INF-γ、IL-4、TNF-a等細(xì)胞因子顯著升高，踝關(guān)節(jié)H-E染色觀察發(fā)現(xiàn)典型的RA炎癥性改變。綜合體征及微觀生物學(xué)指標(biāo)，可認(rèn)為CIA造模成功，熱痹證模型建立。 2．在C

5、IA造模成功的基礎(chǔ)上，采用“人工氣候”試驗(yàn)箱，對(duì)模型大鼠“風(fēng)寒濕”(C組)或“風(fēng)濕熱”(H組)干預(yù)三周，定量分析大鼠舌象，并觀察宏觀體征。結(jié)果顯示，C組大鼠可辨為寒痹證；H組大鼠仍可辨為熱痹證，但兼夾瘀血因素。與M組比較，C組IgG抗體、INF-γ、IL-4、TNF-a水平均顯著下降，Anti-CⅡ抗體亦下降，H組IgG抗體、INF-γ、IL-4水平顯著下降，TNF-a水平亦下降，Anti-CⅡ抗體水平未見明顯改變；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，

6、C組Th1、Th1/Th2均顯著降低，H組僅見Th1/Th2下降，Th1、Th2所占淋巴細(xì)胞比率無明顯變化；熒光實(shí)時(shí)定量(Real-time)PCR技術(shù)測(cè)定顯示，c組T-bet mRNA表達(dá)下調(diào)，IL-4 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，C組和H組INF-γmRNA表達(dá)均下調(diào)，差異均具有顯著性，但T-bet/GATA-3比值兩組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)改變；關(guān)節(jié)H-E染色后觀察顯示，H組與M組相似，均病變重，C組病變較輕，偶見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。綜合宏觀體征和微觀指

7、標(biāo)分析表明，“風(fēng)寒濕”和“風(fēng)濕熱”均能改善Th1/Th2漂移，其中“風(fēng)寒濕”改善更為明顯，但二者對(duì)T-bet/GATA-3比值均無明顯影響。 3．采用同樣的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)M組CIA大鼠灌胃給予宣痹湯(X組)及桂枝芍藥知母湯(G組)三周后顯示，兩組大鼠血清IgG抗體、lNF-γ、IL-4、TNF-a水平均降低，Thl、Th1/Th2均顯著降低，Th2顯著上升，T-bet、INF-TmRNA表達(dá)顯著下調(diào)，IL-4 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)

8、，T-bet/GATA-3在G組有改變，在X組明顯改變。H-E染色顯示，G組病變?nèi)暂^重，X組偶見炎癥細(xì)胞，病變減輕。此外，使用缺口術(shù)端標(biāo)記法(TUNEL)原位檢測(cè)關(guān)節(jié)組織細(xì)胞凋亡顯示，兩組細(xì)胞凋亡率均明顯下降，但X組更明顯。綜合宏觀體征和微觀指標(biāo)，宣痹湯與桂枝芍藥知母湯相比，前者能更好地治療CIA大鼠，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2漂移，下調(diào)T-bet/GATA-3比值。 4．同樣，對(duì)“風(fēng)寒濕”干預(yù)三周后的CIA大鼠，灌胃給予宣痹湯(C+X

9、組)及桂枝芍藥知母湯(C+G組)干預(yù)三周，結(jié)果顯示，C+X組大鼠血清Anti-CⅡ抗體水平顯著上升，Th1，Th1/Th2亦顯著上升，C+G和C+X組均見IL-4 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，僅C+X組T-bet/GATA-3比值上調(diào)。關(guān)節(jié)HE染色后觀察顯示，C+X組炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，與M組病變程度類似，而C+G組單核細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病變減輕。TUNEL原位檢測(cè)關(guān)節(jié)組織細(xì)胞凋亡顯示，與C相比較，C+G組細(xì)胞凋亡率下降，C+X組未見明顯改變，但鏡

10、下觀察顯示C+X組炎癥細(xì)胞、纖維細(xì)胞增加，細(xì)胞凋亡加重。綜合宏觀體征和微觀指標(biāo)，宣痹湯與桂枝芍藥知母湯均未明顯改善經(jīng)“風(fēng)寒濕”干預(yù)三周的CIA大鼠病情，反而，宣痹湯使臨床癥狀、關(guān)節(jié)局部病變，細(xì)胞凋亡惡化，且上調(diào)了T-bet/GATA-3比值，加劇了Th1/Th2漂移。 5．此外，對(duì)“風(fēng)濕熱”干預(yù)三周后的CIA大鼠，灌胃給予宣痹湯(H+X組)及桂枝芍藥知母湯(H+G組)三周，結(jié)果顯示，僅H+G組大鼠血清Anti-CⅡ抗體水平顯著下

11、降，H+G組和H+X組Th1、Th1/Th2均顯著降低，Th2顯著上升，INF-γmRNA表達(dá)均下降，另外，僅H+G組GATA-3 mRNA表達(dá)上調(diào)，T-bet/GATA-3比值下降。關(guān)節(jié)HE染色后觀察顯示，H+G組與H組比較，病變減輕，而H+X組病變?nèi)暂^重。TUNEL法原位檢測(cè)關(guān)節(jié)組織細(xì)胞凋亡顯示，兩組細(xì)胞凋亡率均未明顯改變。綜合宏觀體征和微觀指標(biāo)，宣痹湯與桂枝芍藥知母湯相比，在改善經(jīng)“風(fēng)濕熱”干預(yù)三周后的CIA臨床癥狀和微觀指標(biāo)方面

12、，后者要優(yōu)于前者。 綜上，“風(fēng)寒濕”或“風(fēng)濕熱”外界環(huán)境干預(yù)可導(dǎo)致熱痹證CIA大鼠證候改變，并都能改善CIA熱痹證大鼠的病情，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2漂移，但前者影響更為明顯，后者對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)局部病變無影響。這證明，外界環(huán)境對(duì)痹證證候演變有一定程度的影響，驗(yàn)證了痹證乃“內(nèi)外合邪”的病因?qū)W理論。另外，宣痹湯與桂枝芍藥知母湯相比，前者與熱痹證大鼠的“證候要素”、“病機(jī)”更為相符，能更好地治療CIA熱痹證，逆轉(zhuǎn)Th1/Th2漂移，但與寒

13、痹證CIA大鼠的“證候要素”、“病機(jī)”相反，使寒痹證大鼠病情惡化，加劇Th1/Th2漂移；桂枝芍藥知母湯對(duì)寒痹證大鼠病情及Th1/Th2漂移影響不明顯，但與熱痹證兼夾瘀血因素大鼠的“證候要素”、“病機(jī)”更為相符，能更好改善該證型CIA大鼠病情，但二者對(duì)，Th1/Th2漂移影響相似。這驗(yàn)證了痹證“方證相應(yīng)”理論中，只有治痹方藥與痹證證候之“要素”、“病機(jī)”高度相符，該方藥才能獲得最佳療效的正確觀點(diǎn)。而且，Th1/Th2細(xì)胞亞群漂移程度可能