Graves病中醫(yī)證候與細(xì)胞免疫相關(guān)性及化痰散結(jié)中藥對(duì)Graves小鼠T細(xì)胞亞群的影響.pdf

1、背景：
　　毒性彌漫性甲狀腺腫(GD)是一種器官特異性自身免疫性疾病，約占全部甲亢的90％，其發(fā)病率逐年升高，女性顯著高發(fā)。GD以高代謝癥候群和甲狀腺腫大為主要特征，存在高復(fù)發(fā)率、需長(zhǎng)期用藥、副作用大、停藥指征不明確等問(wèn)題，嚴(yán)重影響患者正常生活。
　　目前普遍認(rèn)為遺傳、外環(huán)境和免疫三個(gè)方面相互作用，共同決定GD的發(fā)病。而近年來(lái)，GD的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制越來(lái)越受關(guān)注，T細(xì)胞亞群及其相關(guān)調(diào)控因子與GD的關(guān)系研究成為熱點(diǎn)。T細(xì)胞及其相

2、關(guān)調(diào)控因子等參與免疫應(yīng)答并產(chǎn)生促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)等自身抗體，從而引起GD的發(fā)生和發(fā)展。臨床針對(duì)Graves病主要有抗甲狀腺藥物(ATD)治療、131I治療和手術(shù)治療等手段。其中抗甲狀腺藥物療法是最常用的方法，但其副作用大，易復(fù)發(fā)。而祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療Graves病具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以減少甲狀腺藥物用量和減輕甲狀腺藥物副作用。中醫(yī)認(rèn)為痰是GD產(chǎn)生的重要原因，貫穿于甲狀腺腫大的始終，也是GD證候的基礎(chǔ)，與其他病因結(jié)合，形成不同的證候

3、類型。因此化痰散結(jié)法是中醫(yī)治療GD的根本所在，可以有效改善GD患者甲狀腺腫大。
　　前期實(shí)驗(yàn)研究非含碘化痰散結(jié)中藥治療GD的機(jī)制，證明化痰散結(jié)中藥能抑制甲狀腺細(xì)胞增殖，促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞凋亡，影響B(tài)ax、Bcl-2表達(dá)，改善甲狀腺細(xì)胞增殖/凋亡的動(dòng)力學(xué)平衡關(guān)系。但是，目前尚沒(méi)有針對(duì)GD的中醫(yī)證候與T細(xì)胞亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫的相關(guān)性的探索，且化痰散結(jié)中藥對(duì)GD細(xì)胞免疫的干預(yù)機(jī)制研究亦較少，嚴(yán)重限制了中藥的廣泛應(yīng)用。因此，本研究是以Grav

4、es病為核心，臨床實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)證候?yàn)榱⒆泓c(diǎn)，以細(xì)胞免疫為切入點(diǎn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以Ad-TSHR289病毒免疫的小鼠構(gòu)建GD模型為載體，以非含碘化痰散結(jié)中藥為干預(yù)措施，以T細(xì)胞亞群為對(duì)象，進(jìn)一步探討GD中醫(yī)證候與細(xì)胞免疫的相關(guān)性，化痰散結(jié)中藥對(duì)T細(xì)胞業(yè)群的影響機(jī)制，具有一定的臨床參考意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　目的：
　　1.探討GD患者的中醫(yī)證候與細(xì)胞免疫的相關(guān)性。
　　2.探討化痰散結(jié)中藥對(duì)GD小鼠模型脾臟T細(xì)胞亞群的影響。

5、>　　方法：
　　1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院內(nèi)分泌科門診收集30例GD患者，其中16例甲功異常者，14例經(jīng)治療后甲功正常者，以20例健康成人作為正常對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)分析各組之間的一般情況、癥狀體征、甲功、免疫學(xué)指標(biāo)（流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD4、CD8、Treg、Th17細(xì)胞比例，PCR法檢測(cè)Foxp3、RORγt的mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)IL-10、IL-17含量），采用多重線性回歸方法分析中醫(yī)證候與免疫學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性。

6、>　　2.采用PCR融合擴(kuò)增獲得質(zhì)粒，Gateway技術(shù)構(gòu)建載體，并進(jìn)行腺病毒包裝，成功構(gòu)建Ad-TSHR289重組腺病毒。通過(guò)腺病毒免疫小鼠制備GD動(dòng)物模型，按照正常組小鼠T4、TRAb的((x)+3s)篩選成模小鼠，進(jìn)行化痰散結(jié)中藥干預(yù)，采用放射免疫法檢測(cè)血清T4、TRAb水平，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脾臟T細(xì)胞亞群(CD4、CD8、Treg、Th17細(xì)胞)的比例，分析化痰散結(jié)中藥對(duì)T細(xì)胞亞群的影響。
　　結(jié)果：
　　1.GD患

7、者的中醫(yī)證候特點(diǎn)
　　GD患者的中醫(yī)證候歸納為氣滯痰凝證、心肝火旺證、陰虛內(nèi)熱證，其中氣滯痰凝證13例（占43.3％），心肝火旺證10例（占33.3％），陰虛內(nèi)熱證7例(占23.3％)。
　　2.各組免疫學(xué)指標(biāo)
　　2.1 CD4、 CD8、Treg、Th17細(xì)胞比例:正常組、GD甲功正常組和GD甲功異常組的全血CD4、CD8、Treg細(xì)胞比例相比，P＞0.05，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組Th17細(xì)胞比例相比，GD甲功正常組

8、（3.10±0.48）、GD甲功異常組（3.57±0.31）均明顯高于正常組（2.25±0.30），P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GD甲功異常組高于GD甲功正常組，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2 Foxp3、RORγt的mRNA表達(dá):正常組、GD甲功正常組和GD甲功異常組的Foxp3、RORγt的mRNA表達(dá)水平比較，P＞0.05，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3 IL-10、IL-17水平:正常組、GD甲功正常組和

9、GD甲功異常組的IL-10、IL-17水平比較，P＞0.05，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.GD的中醫(yī)證候與免疫學(xué)指標(biāo)的關(guān)系
　　氣滯痰凝證與CD4、 CD8、Treg、Th17、Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17均無(wú)明顯相關(guān)性，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心肝火旺證與CD8細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)（β=-0.509，P=0.008＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與CD4、Treg、Th17、Foxp3、RORγt、 IL-

10、10、IL-17均無(wú)明顯相關(guān)性，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陰虛內(nèi)熱證與CD8細(xì)胞比例呈正相關(guān)(β=0.440，P=0.039＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與CD4、Treg、Th17、Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17均無(wú)明顯相關(guān)性，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)GD成模率達(dá)到61.7％。
　　5.化痰散結(jié)中藥對(duì)T4、TRAb的影響
　　藥物干預(yù)后，各組T4相比，中藥大劑量組（95.72

11、±20.86）、西藥組（99.12±19.39）明顯低于模型組（145.18±20.53），P＜0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中藥小劑量組（124.21±19.61）低于模型組，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　藥物干預(yù)后，各組TRAb相比，中藥大劑量組（15.69±7.43）、西藥組（18.25±8.30）低于模型組（45.37±15.31），P＜0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中藥小劑量組（32.11±10.81）低于模型組，

12、P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.化痰散結(jié)中藥對(duì)CD4、 CD8、Treg、Th17細(xì)胞比例的影響
　　藥物干預(yù)后，小鼠脾臟的CD4、CD8、Treg、Th17細(xì)胞比例各組之間相比，P＞0.05，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.分析GD患者的中醫(yī)證候與細(xì)胞免疫的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)心肝火旺證與CD8細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，陰虛內(nèi)熱證與CD8細(xì)胞比例呈正相關(guān)，而上述兩種證候與CD4、 Treg、Th17、Foxp3、