阿膠低肽制備工藝及其質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、研究目的與意義：
　　 阿膠是著名中藥，以補(bǔ)血升血功效可靠而著稱。但由于阿膠的主要成分85％以上是膠原蛋白，膠原蛋白口服后需要被蛋白酶降解為低肽或氨基酸后才能吸收。然而阿膠的適應(yīng)癥人群——血虛病人，往往是脾胃虛弱，消化能力低下，服用阿膠對其消化系統(tǒng)負(fù)擔(dān)加重，消化功能進(jìn)一步降低，阿膠藥效也不能充分發(fā)揮。因此，阿膠素有“滋膩礙胃”之說。
　　 另一方面，阿膠對于腫瘤病人由于放化療導(dǎo)致的貧血（血虛）有較理想的療效，但放化療病人

2、有嚴(yán)重的消化道副反應(yīng)，嘔吐、惡心使得病人服用阿膠變得非常困難。同時(shí)，化療使得病人胃腸功能被嚴(yán)重削弱，消化能力大幅下降，將會進(jìn)一步加劇阿膠的“滋膩礙胃”之弊。因此，研究易吸收的阿膠制劑，開發(fā)阿膠注射給藥劑型是阿膠研發(fā)急需解決的重大問題。
　　 研究阿膠的新制劑、新劑型必須解決阿膠及其新制劑的質(zhì)量控制方法問題。目前阿膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有特異性的定性定量方法，《中國藥典（2005版）》僅有氨基酸含量測定等不能特異性控制阿膠原料、工藝等的指標(biāo)

3、。特別是近年來由于原料緊缺導(dǎo)致假冒偽劣產(chǎn)品較多，嚴(yán)重的影響人民群眾安全有效的用藥。研究阿膠特異性檢測技術(shù)和方法，也是阿膠研究的重大而緊迫的課題。
　　 本文基于：
　　 1、阿膠成分85％以上是膠原蛋白，2、口服有效，3、蛋白類成分口服后必須被胃蛋白酶、胰蛋白酶降解為低肽或氨基酸才能被吸收，4,阿膠降解為氨基酸后已不能代表阿膠的藥效等四點(diǎn)科學(xué)共識，提出了“阿膠的主要生物活性物質(zhì)是阿膠含有的膠原蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶降解

4、后的、能被機(jī)體吸收且有良好生物相容性的阿膠低肽”的工作假說，在此基礎(chǔ)上按照仿生學(xué)的理論運(yùn)用生物酶提取阿膠藥效物質(zhì)-阿膠低肽，研制成注射用阿膠低肽凍干粉和易吸收療效高的口服阿膠低肽。在研究阿膠新制劑、新劑型的同時(shí)，運(yùn)用分子篩、HPLC-Ms、MALDI-TOF-MS、FAB-MS、ESI-MS等技術(shù)研究、測定了阿膠特征肽的氨基酸序列，對阿膠及其新制劑特異性質(zhì)控方法進(jìn)行了研究。
　　 研究內(nèi)容與結(jié)果：
　　 一.不同分子量段

5、阿膠低肽的制備
　　 采用生物酶耦合膜分離技術(shù)提取純化阿膠藥效物質(zhì)并制成注射用凍干粉：將阿膠制成膠漿，脫脂，脫脂膠漿先后用胃蛋白酶、胰蛋白酶降解，降解條件經(jīng)優(yōu)化為：胃蛋白酶酶量10萬U/g、胃蛋白酶酶解時(shí)間為2小時(shí)、酶解pH2.0、酶解溫度42℃；胰蛋白酶酶量為5千U/g、胰蛋白酶酶解時(shí)間3小時(shí)，酶解pH為8.0，酶解溫度42℃。酶解液除酶，用分子量截流值為30kD、10kD、5kD、3kD、1kD的超濾柱超濾，獲得相應(yīng)的不同分

6、子量段的阿膠低肽藥液。不同分子量段的阿膠低肽藥液分別通過大孔吸附樹脂柱，去除雜質(zhì)后，再用葡聚糖凝膠層析等手段進(jìn)行了阿膠低肽的純化。
　　 二.以具有良好生物相容性和藥效為指標(biāo)，選擇注射用阿膠低肽的分子量，
　　 阿膠含有膠原蛋白，研制注射用阿膠低肽首先要考慮將阿膠膠原蛋白降解至具有良好的生物相容性，不得有任何過敏反應(yīng)。同時(shí)為了保證阿膠的藥效，阿膠膠原蛋白又不能完全降解為氨基酸。為此，本文首先對注射用阿膠低肽的分子量進(jìn)行了

7、選擇。將各分子段的藥液進(jìn)行致敏性試驗(yàn)，確定注射用阿膠低肽的安全分子量為<3kD。用上述藥液進(jìn)行了藥效學(xué)試驗(yàn)， <3kD的注射用阿膠低肽升高血色素、紅血球、白血球的效果顯著由于口服阿膠（口服阿膠劑量按氨基酸計(jì)算是<3kD注射用阿較低肽劑量的25倍的前提下）P<0.05。確定了注射用阿膠低肽分子量為<3kD，
　　 三.以藥效為指標(biāo)，確定口服阿膠低肽的分子量
　　 在確定了注射用阿膠低肽的分子段后，根據(jù)臨床需要我們又以藥效為

8、指標(biāo)，選擇了口服阿膠低肽的分子量段，將<1kD、<3kD、<5kD、<10kD、<30kD的不同分子量段的阿膠低肽以同等劑量灌胃給藥，比較其升高血色素、紅血球、白血球的作用，結(jié)果顯示，口服阿膠低肽以<5kD最佳。。
　　 四. 阿膠低肽量效關(guān)系的建立
　　 為了減少藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)較高的研究費(fèi)用和繁重的工作量，是研究結(jié)果與將來生產(chǎn)實(shí)際緊密相結(jié)合，我們尋求以阿膠低肽量的比較取代藥效強(qiáng)弱的比較，探索了注射用阿膠低肽的量效關(guān)系。結(jié)果

9、顯示：在實(shí)驗(yàn)的給藥劑量范圍內(nèi)，阿膠低肽劑量(按氨基酸計(jì)算)與Hb和RBC提升程度呈正相關(guān)。同分子量段的阿膠低肽劑量的變化可以反映其藥效強(qiáng)弱的變化。
　　 五.阿膠低肽含量測定的方法學(xué)研究
　　 進(jìn)行了考馬斯亮藍(lán)法測定阿膠低肽的方法學(xué)考察（標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0054x+0.7316，牛血清白蛋白含量在0～80μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R=0.9991）并將含量測定與藥效聯(lián)系，以分子量<3kD的肽含量為指標(biāo)，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)

10、選了阿膠的酶提取工藝，同時(shí)進(jìn)行了藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)論與采用含量測定的方法一致。
　　 六.阿膠低肽的純化
　　 運(yùn)用超濾、大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠層析等手段進(jìn)行了阿膠低肽的純化。阿膠酶提取液依次通過分子量截流值為30kD和3kD或5kD的超濾柱（<5kD組分即口服阿膠低肽可直接進(jìn)行干燥），然后上大孔吸附樹脂柱，洗脫收集低肽組分，低肽組分采用SephadexG-25柱純化，得到純化液置-40℃預(yù)冷2h后，冷凍干燥，即得阿膠低

11、肽凍干粉。
　　 七.阿膠特征肽的分離與結(jié)構(gòu)測序
　　 對阿膠低肽凍干粉溶液進(jìn)一步分離，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)研究。采用SephadexG-25分離凍干粉水溶液，選擇211nm作為檢測波長，對流出液進(jìn)行了單波長掃描。結(jié)果分離得到3個(gè)峰，棄去峰面積很小的1峰，選擇第2、3峰收集。并對其進(jìn)行了HPLC分離，測定了其圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3號峰的HPLC圖譜較為穩(wěn)定，通過制備性HPLC進(jìn)行組分收集。進(jìn)行了MALDI-TOF-MS檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶

12、解時(shí)間對產(chǎn)物有較大影響。從另外一個(gè)角度說明阿膠低肽隨著酶解時(shí)間的延長，先增多，后逐漸減少。同時(shí)證明主要的藥效物質(zhì)存在于分子量1000D～1900D。又由于近紫外干擾較為明顯，采用了ESI-MS，該圖譜不僅穩(wěn)定,而且特征性強(qiáng),可用于相關(guān)制劑中阿膠的快速指紋鑒別，結(jié)果2號峰的12min峰為一特征肽段，序列為GSEGPQGVR；3號峰的13min峰為一特征肽段，序列為PGEAGLPGAK。特征肽段的分析采用了FAB-MS法進(jìn)行測定。
　

13、　 八.阿膠特異性鑒別方法的研究
　　 1.旋光分析法：對阿膠及其偽品（馬皮膠，牛皮膠）采用了旋光分析、結(jié)果顯示，結(jié)果表明，驢皮膠旋光度= - 0.35，牛皮膠旋光度= - 0.38，馬皮膠旋光度= - 0.39，雜皮膠旋光度均小于驢皮膠。但是含有20％雜皮的旋光度不能與純驢皮膠鑒別。蛋白結(jié)合糖含量化學(xué)分析為測定在620nm下的吸收度，結(jié)果表明，驢皮膠A620nm=0.34，牛皮膠A620nm=0.31，馬皮膠A620nm=0

14、.44。該方法可以較好的
　　 區(qū)分驢皮膠和馬皮膠，但牛皮膠區(qū)分效果較差。
　　 2.質(zhì)譜特征峰分析法：利用MALDI-TOF質(zhì)譜對三種膠進(jìn)行掃描，不同皮膠的平均分子量不同，阿膠的平均分子量為28.5KD，牛皮膠和馬皮膠均高于阿膠。但是由于制作工藝有可能對水解程度有影響，這種方法僅作一種參考。低分子量組分HPLC-MS方法分析穩(wěn)定性和重復(fù)性好，但不同批次膠低分子量組分組成不穩(wěn)定，且組分繁多，各組分均為未知，混合膠分析難度

15、高。但3號峰圖譜中馬皮膠在11min處多出一峰，是馬皮膠的特征峰。酶解物組分HPLC-MS分析盡管數(shù)據(jù)量很大，但是圖譜穩(wěn)定，且能在牛皮膠中發(fā)現(xiàn)特征肽。單純采用酶解物進(jìn)行分析。在乙腈-水體系中，驢皮膠的峰較具有特征，且重復(fù)性良好；在三氟乙酸體系中，馬皮膠的峰較具有特征，且重復(fù)性良好；是一種鑒定的新途徑。
　　 九.初步藥效試驗(yàn)和安全性評價(jià)
　　 初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)（升血作用實(shí)驗(yàn)、免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)、抗疲勞實(shí)驗(yàn)）證明，本文工藝制備的注

16、射用阿膠低肽、口服阿膠低肽，在提升Hb、RBC、WBC方面均顯著優(yōu)于阿膠，有較好的免疫增強(qiáng)作用。且無致敏性，無明顯毒副作用。
　　 本文創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1.運(yùn)用仿生學(xué)的理論和方法，對阿膠進(jìn)行生物酶降解，從其降解產(chǎn)物中分離低肽類有效成分，解決了膠原蛋白類成分分離純化、結(jié)構(gòu)解析難度大，無法注射給藥的問題，為動(dòng)物膠類乃至蛋白類中藥的深入研發(fā)提供了新思路、新方法。
　　 2.首次從阿膠的酶降解產(chǎn)物中分離到兩種特征肽，并進(jìn)