內(nèi)皮抑制素和白介素12聯(lián)合基因治療小鼠肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:肝癌在中國屬于高發(fā)病癥,治療手段有限,近年來生物治療發(fā)展尤有前景.單一的內(nèi)皮抑制素抑血管基因治療雖然有效,但并不能完全根除腫瘤細(xì)胞,而兼有抑血管作用的白介素12(IL-12)免疫基因治療正好可彌補(bǔ)這一缺陷.聯(lián)合內(nèi)皮抑制素和IL-12的雙靶點(diǎn)基因治療一方面可能取得抑制血管形成促進(jìn)腫瘤"休眠"的協(xié)同效應(yīng),另一方面利用IL-12誘導(dǎo)的強(qiáng)大抗瘤免疫有望根除殘余腫瘤細(xì)胞,在肝癌的治療方面有著較大的理論價(jià)值和臨床意義.該課題擬采用安全、低毒、

2、低免疫原性的質(zhì)粒載體表達(dá)小鼠內(nèi)皮抑制素和IL-12,進(jìn)行瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染,觀察二者聯(lián)合治療小鼠種植性肝癌的效果并探討其作用機(jī)制.方法:人工合成小鼠Igκ輕鏈信號肽序列的兩條互補(bǔ)單鏈,使其退火形成含粘性末端的DNA雙鏈.提取乳鼠肝臟總RNA,RT-PCR擴(kuò)增出小鼠內(nèi)皮抑制素編碼序列,限制性內(nèi)切酶消化,回收目的片斷,和信號肽序列一起連接入真核表達(dá)載體pcDNA3.1相應(yīng)多克隆位點(diǎn)上.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,小量提取質(zhì)粒,電泳篩選,對重組體進(jìn)行酶切

3、鑒定和序列測定分析,得到正確的重組內(nèi)皮抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒.同時(shí)對獲贈的小鼠IL-12真核表達(dá)質(zhì)粒也進(jìn)行酶切鑒定.結(jié)論:成功構(gòu)建了分泌性小鼠內(nèi)皮抑制素真核表達(dá)質(zhì)粒,它和小鼠IL-12真核質(zhì)粒在體外均具有良好的生物學(xué)活性.小鼠內(nèi)皮抑制素質(zhì)粒和IL-12質(zhì)粒經(jīng)PVP介導(dǎo)可以有效的在瘤內(nèi)表達(dá),促進(jìn)瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤,共同抑制腫瘤血管形成,協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,對小鼠肝癌病灶具有很好的協(xié)同治療效果,有進(jìn)一步應(yīng)用于其他實(shí)體腫瘤治療研究和進(jìn)行初步臨床試