二甲基精氨酸-二甲胺水解酶對內皮祖細胞衰老的調控與糖尿病血管功能障礙.pdf

1、第一章、二甲基精氨酸-二甲胺水解酶對內皮祖細胞分化及功能的調控作用
　　 背景：
　　 內皮祖細胞是一類能分化為成熟的內皮細胞及心肌細胞,促進血管新生和改善心功能的干細胞。EPCs參與血管修復和血管新生,為治療缺血性疾病提供了新的策略。
　　 血管內皮生長因子是調節(jié)EPCs功能最強的因子。VEGF與2型VEGF受體(KDR)相互作用而調節(jié)EPCs功能,包括內皮修復與血管新生。
　　 二甲基精氨酸-二甲胺水

2、解酶能特異性的水解L-精氨酸的同類物非對稱二甲基精氨酸。ADMA是一種主要的內源性一氧化氮合酶抑制物,能競爭性抑制NOS,減少一氧化氮合成。研究發(fā)現,內皮細胞衰老和血管新生涉及DDAH/ADMA途徑。
　　 人類沉默信息調節(jié)因子2(Silent information regulator2,Sir2)SIRT1是Ⅲ型組蛋白去乙?；鞍?能引起基因表達沉默。研究發(fā)現,SIRT1通過DDAH/ADMA途徑抑制內皮細胞衰老。文獻報道,

3、高糖誘導EPCs衰老涉及SIT1途徑。
　　 基于DDAIMADMA與SIRT1參與血管新生及細胞衰老的調節(jié)以及SIRT1介導DDAH/ADMA途徑的效應,我們推測DDAH/ADMA可能通過VEGF/KDR途徑參與EPCs分化與功能的調控,該作用可能涉及SIRT1途徑。因此,本實驗在體外培養(yǎng)人外周血來源EPCs研究了DDAH/ADMA對EPCs功能與衰老的影響。
　　 方法：
　　 EPCs培養(yǎng)與鑒定:梯度離心加

4、選擇性粘附分離健康人外周血EPCs,用內皮基礎培養(yǎng)基EBM-2培養(yǎng)EPCs。培養(yǎng)7天后鑒定,包括乙?；兔芏戎鞍着c荊豆凝集素1雙染鑒定分化EPCs;流式細胞儀檢測細胞CD133、CD34、CD45、KDR、vWF等標記物表達。
　　 DDAH對EPCs分化及功能調控及機制:提取分化第7天的EPCs,檢測DDAH1和DDAH2表達;提取第7和17天EPCs,檢測JDDAH2、SIRT1表達。為了探討DDAH2對EPCs功能的調控

5、,運用pGCSIL-GFP-hDDAH2慢病毒轉染EPCs沉默DDAH2表達;為了探討SIRT1對DDAH2表達的調控,運用pGCSIL-GFP-hSIRT1慢病毒轉染EPCs沉默SIRT1表達。提取細胞mRNA,Real-time PCR檢測DDAH1、DDAH2、SIRT1、VEGF和KDR mRNA表達;流式細胞儀和WesternBlot檢測DDAH2和SIRT1蛋白表達;高效液相色譜法(highperformance liqui

6、d chromatography,HPLC)檢測細胞上清ADMA;β-半乳糖苷酶活性評價EPCs衰老程度:tubedx管形成實驗評價EPCs血管形成能力;纖維連接蛋白檢測EPCs粘附能力。
　　 結果：
　　 人外周血EPCs主要以DDAH2亞型表達為主,且隨著EPCs分化時間延長而增加。
　　 結論：
　　 DDAH2參與EPCs分化過程,并通過調節(jié)VEGF/KDR途徑抑制EPCs的衰老,其作用機制涉及

7、SIRT1途徑。
　　 第二章、二甲基精氨酸一二甲胺水解酶/非對稱二甲基精氨酸在2型糖尿病內皮祖細胞衰老中的作用及機制
　　 研究背景
　　 血管病變是糖尿病主要并發(fā)癥之一。臨床與動物實驗發(fā)現糖尿病時,EPCs衰老率顯著增加、功能受損。高糖能誘導EPCs衰老、血管形成能力減弱,導致糖尿病血管功能減弱、側枝循環(huán)建立減少,引發(fā)心血管疾病。
　　 ADMA是一種新的心血管疾病預測因子,是內源性NOS抑制物,能競

8、爭性抑制NOS,減少NO的合成。糖尿病時,細胞DDAH2表達降低、活性減弱,引起ADMA濃度增加并抑制NO生成。臨床與動物實驗證明,糖尿病時EPCs功能受損與NO濃度降低有關。細胞實驗證明,ADMA能直接損傷EPCs功能。
　　 糖尿病或高糖孵育EPCs時,EPCs SIRT1表達下調,同時伴隨細胞衰老和血管形成功能減退。內皮細胞實驗發(fā)現,SIRT1可上調DDAH2表達,增加活性,促進ADMA水解,抑制內皮細胞自然衰老過程。

9、r>　　 本實驗在2型糖尿病患者與培養(yǎng)EPCs細胞探討了EPCs衰老與DDAH/ADMA之間的關系,以及該過程是否涉及SIRT1途徑。
　　 方法：
　　 臨床研究:對照組與2型糖尿病患者組各40例。取外周靜脈血,分離血漿與細胞。HPLC檢測血漿ADMA濃度;梯度離心加粘附分離細胞EPCs,β-半乳糖苷酶活性評價細胞衰老,Real-time PCR法檢測細胞DDAH2、SIRT1 mRNA表達。
　　 細胞實驗

10、:外源性給予葡萄糖(10,20,30 mmol/L)孵育EPCs建立高糖損傷EPCs細胞模型,以甘露醇(10,20,30 mmol/L)作為滲透壓對照組,探討高糖誘導EPCs衰老;構建pGC-FU-hDDAH2慢病毒探討DDAH2抑制高糖誘導EPCs衰老;外源性給予ADMA(0,0.3,0.6,1μtmol/L)探討ADMA誘導EPCs衰老作用;運用SIRT1激動劑白藜蘆醇探討SIRT1調節(jié)高糖誘導細胞衰老作用機制。
　　 梯度

11、離心加粘附分離正常人外周血EPCs。細胞處理48 h后,β-半乳糖苷酶活性評價細胞衰老。其他指標的檢測為細胞處理24 h時,Real-time PCR與Western Blot檢測DDAH2、SIRT1 mRNA與蛋白表達,HPLC檢測細胞上清ADMA水平,Griess法檢測上清NO水平。
　　 結果：
　　 2型糖尿病患者外周血EPCs衰老率顯著升高,DDAH2與SIRT1mRNA表達下調,同時伴隨ADMA水平升高。<

12、br>　　 結論：
　　 DDAH2/ADMA參與了高糖誘導的EPCs衰老,其作用涉及SIRT1途徑。
　　 第三章、白藜蘆醇衍生物改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及抑制內皮祖細胞衰老
　　 背景：
　　 白藜蘆醇(resveratrol,RSV)是一種多酚類的SIRT1天然激動劑。SIRT1參與糖代謝和胰島素分泌的調節(jié)。糖尿病大鼠實驗證明,RSV能上調VEGF與eNOS表達,抑制氧化應激反應,提高糖尿病大

13、鼠骨髓細胞血管形成能力。細胞實驗證明,RSV促進人外周血EPCs增殖、遷移以及血管新生。此外,RSV也能抑制TNF-α所致EPCs損傷。
　　 (E)-3,5,4'-三甲氧基-1,2-二苯乙烯((E)-3,5,4'-trimethoxystilbene,BTM-0512)是RSV的甲基化衍生物,其口服吸收率與半衰期均優(yōu)于RSV。
　　 依據RSV對血管內皮和EPC保護作用以及SIRT1-DDAH2/ADMA對EPCs功能

14、及衰老的調節(jié)作用,本實驗在高脂飲食加單次腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘發(fā)的2型糖尿病大鼠模型與培養(yǎng)大鼠骨髓EPCs細胞,探討RSV衍生物BTM-0512能否改善胰島素抵抗,以及對EPCs衰老的影響及機制。
　　 方法：
　　 動物實驗:高脂飲食加單次腹腔注射STZ(35 mg/kg)建立2型糖尿病大鼠模型。實驗分為正常對照組、模型組、BTM-0512低劑量組(10 mg/kg)和BTM-05

15、12高劑量組(40 mg/kg)。大鼠連續(xù)灌胃3周。
　　 取大鼠全血,分離血漿檢測大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(Hb1AC)、葡萄糖耐量(OGTT)、HOME.IR、胰島素敏感指數(IAI)、胰島素分泌指數(IS)以及ADMA濃度。切取胸主動脈觀測內皮依賴性舒張反應,免疫組化檢測血管內皮DDAH2、SIRT1蛋白表達。采用梯度離心加選擇性粘附分離大鼠骨髓EPCs細胞,β-半乳糖苷酶活性評價細胞衰老程度,Real-tim

16、e PCR檢測EPCs DDAH2、SIRT1mRNA表達,tube小管形成實驗檢測EPCs血管形成能力,transwell小室評價EPCs遷移能力,纖維連接蛋白粘附法評價EPCs粘附能力。
　　 細胞實驗:高糖處理EPCs,探討B(tài)TM-0512(0.3,1,3μM)抑制高糖誘導EPCs衰老及可能機制,給予SIRT1特異性阻斷劑splitomicin(50μM)探討SIRT1在BTM-0512對EPCs保護中作用。Β-半乳糖苷酶

17、活性評價細胞衰老,Real-time PCR檢測DDAH2、SIRT1 mRNA表達,Western Blot檢測DDAH2蛋白表達;HPLC檢測細胞上清ADMA水平。
　　 結果：
　　 BTM-0512能劑量依賴性降低2型糖尿病大鼠FBG和Hb1AC,改善HOME.IR和IAI,但對OGTT與IS沒有影響。
　　 在培養(yǎng)EPCs,BTM-0512能劑量依賴性抑制高糖誘導細胞衰老,上調細胞DDAH2、SIRT1