慢病毒介導(dǎo)的Nanog基因?qū)χ車窠?jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓突觸重塑的影響.pdf

1、研究背景及目的：神經(jīng)病理性疼痛（Neuropathic Pain，NPP）是外周或中樞軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷或病變引起的一種頑固性疼痛綜合征，以自發(fā)性疼痛（Spontaneous pain）、痛覺過敏（Hyperalgesia）和觸摸痛（Allodynia）為特點(diǎn)。NPP的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，治療效果不佳，是目前研究的熱點(diǎn)。目前國內(nèi)外研究普遍認(rèn)為抑制核因子-κB（NF-κB）的激活可以緩解動物的機(jī)械性感覺異常和熱痛覺過敏，因此抑制NF-κB

2、的激活是一個有潛力的NPP治療策略。此外，在胚胎干細(xì)胞的自我更新與分化機(jī)制研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Nanog通過與NF-κB家族各蛋白相結(jié)合抑制它們的轉(zhuǎn)錄活性和促分化能力，從而維持胚胎干細(xì)胞的多能性。用Nanog來抑制NF-κB的活性可能是一個有效的治療NF-κB過度激活所引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。我們前期的實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Nanog基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的NF-κB表達(dá)明顯減弱。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上

3、，從而達(dá)到持久性表達(dá)，起到良好的基因治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。為探討Nanog基因?qū)χ車窠?jīng)損傷性NPP的治療機(jī)制和效果，我們構(gòu)建Nanog基因慢病毒載體質(zhì)粒，進(jìn)行慢病毒的包裝、濃縮、滴度測定和鑒定，接著通過體外實(shí)驗(yàn)研究Nanog基因?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，最后進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察Nanog基因?qū)Υ笫笾車窠?jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓突觸重塑的影響。本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 攜帶Nanog基因

4、慢病毒重組載體質(zhì)粒（pNL-Nanog-IRES2-EGFP）的構(gòu)建及鑒定
　　材料與方法：雙酶切（NheI/BamHI）克隆質(zhì)粒pUC57-Nanog和慢病毒載體質(zhì)粒pNL-IRES2-EGFP，膠回收目的基因片段。T4連接酶連接回收的目的片段。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌后涂于含抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板37℃12-16小時。挑選菌落進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確的菌落搖菌后進(jìn)行質(zhì)粒的小量提取，最后雙酶切和測序鑒定。
　　結(jié)果：經(jīng)雙酶

5、切和測序鑒定pNL-Nanog-IRES2-EGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建大鼠Nanog基因慢病毒重組載體質(zhì)粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP，為研究Nanog基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 攜帶Nanog基因慢病毒載體的包裝、濃縮、滴度測定和鑒定
　　材料與方法：將慢病毒載體質(zhì)粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP、包裝質(zhì)粒
　　pHELPER和包膜質(zhì)粒pVSVG共轉(zhuǎn)染293T

6、細(xì)胞，包裝生產(chǎn)慢病毒。收集病毒懸液，離心取上清，0.45um濾器過濾，加入含聚乙二醇（PEG）的濃縮試劑，混勻后4℃過夜，離心取沉淀，PBS重懸后分裝，-80℃保存。倍比稀釋法測定慢病毒滴度。RT-PCR和Western Blot檢測NanogmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：三質(zhì)粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后成功產(chǎn)生出了慢病毒。病毒原液經(jīng)濃縮后的功能滴度為2×10

7、7TU/mL以上。RT-PCR和Western Blot檢測證實(shí)慢病毒感染的293T細(xì)胞中有NanogmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　結(jié)論：包裝生產(chǎn)出了高滴度攜帶Nanog基因的慢病毒，為進(jìn)一步的體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
　　第三部分 脂質(zhì)體介導(dǎo)的Nanog基因轉(zhuǎn)移抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　材料與方法：無菌條件下分離出生后2-3天Sprague-Dawley（SD）大鼠的大腦皮質(zhì)，去除腦膜和血

8、管，切碎，胰酶消化，200目濾網(wǎng)過濾，制成細(xì)胞懸液后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8天后加入鹽酸利多卡因進(jìn)行分離純化。取3-8代細(xì)胞進(jìn)行體外刺激和干預(yù)實(shí)驗(yàn)，分為正常對照組、LPS單獨(dú)刺激組、不同濃度pNL-Nanog-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染（1.0、2.0、3.0）后LPS刺激組。在不同的時間點(diǎn)用MTT檢測各組細(xì)胞的增值能力，RT-PCR檢測各組細(xì)胞β-actin、Nanog、IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平，ELISA檢測各組

9、細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Nanog和LPS對小膠質(zhì)細(xì)胞的生長狀態(tài)沒有明顯影響。Nanog可以降低LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nanog可以阻止LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎癥因子的釋放，減弱細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，具有抗炎作用。
　　第四部分 慢病毒載體介導(dǎo)的Nanog基因轉(zhuǎn)移對大鼠周圍神經(jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼痛模型

10、脊髓突觸重塑的影響
　　材料與方法：雄性SD大鼠40只，4-5月齡，體重180-200克，隨機(jī)分為5組即假手術(shù)組、雙側(cè)壓迫性坐骨神經(jīng)損傷（bCCI）組、bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組和bCCI+LV-Nanog-EGFP組，每組8只。bCCI術(shù)后第1天，分別向bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組和bCCI+LV-Nanog-EGFP組大鼠L4-L6脊髓節(jié)段雙側(cè)分別直接注射2μL生理鹽水、LV-EGFP

11、和LV-Nanog-EGFP。術(shù)前及術(shù)后每隔3天進(jìn)行機(jī)械痛閾、熱痛閾和冷痛閾的測定。術(shù)后第90天處死大鼠，取脊髓，制作切片。熒光顯微鏡下觀察脊髓背角綠熒光蛋白的表達(dá)情況，甲苯胺藍(lán)染色觀察神經(jīng)元的數(shù)量，免疫組織化學(xué)染色觀察突觸素（Syn）、P65、Mu阿片受體（MOR）和膽囊收縮素8（CCK-8）的表達(dá)水平，體視學(xué)影像系統(tǒng)分析突觸數(shù)量的變化及其與神經(jīng)元的比例。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組相比bCCI組于術(shù)后第4天起機(jī)械痛閾值、熱痛閾值、冷

12、痛閾值開始下降，三者分別于術(shù)后第16、13、21天降至最低（P<0.05），機(jī)械痛閾值和熱痛閾值分別于45和33天回到基線，而冷痛閾值持續(xù)到術(shù)后第90天仍遠(yuǎn)離基線。bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組與bCCI組相比痛閾無顯著改善（P>0.05）。bCCI+LV-Nanog-EGFP組與bCCI組相比痛閾顯著改善（P<0.05）。甲苯胺藍(lán)染色染色顯示各組脊髓背角神經(jīng)元數(shù)量無明顯差異（P>0.05）。免疫組織化學(xué)染色顯示與假手

13、術(shù)組相比bCCI組、bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組Syn、P65表達(dá)明顯增加（P<0.05），MOR、CCK-8表達(dá)明顯下降（P<0.05）；bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組與bCCI組相比各指標(biāo)無明顯差異（P>0.05）；bCCI+LV-Nanog-EGFP組與bCCI組相比各指標(biāo)有顯著性差異（P<0.05）。體視學(xué)影像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)顯示突觸和神經(jīng)元數(shù)量的比例bCCI組、bCCI+生理鹽水組、bCCI+

14、LV-EGFP組較假手術(shù)組顯著增加（P<0.01），bCCI+生理鹽水組、bCCI+LV-EGFP組與bCCI組相比無明顯差異（P>0.05）；bCCI+LV-Nanog-EGFP組與bCCI組相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)的Nanog基因脊髓背角直接注射可以減少bCCI后脊髓背角Syn、P65的表達(dá)，增加MOR、CCK-8的表達(dá)，降低突觸和神經(jīng)元數(shù)量的比例，提高疼痛閾值水平，具有治療神經(jīng)病理性疼痛的作用