siRNA封閉IGFIR蛋白表達(dá)治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、957399例犬博士學(xué)位論文(2006屆)siRNA封閉IGFIR蛋白表達(dá)治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究HumanIGFIRGeneTherapyofLiverCancerMediatedbys譴tNA研究生姓名指導(dǎo)教師姓名專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)研究方向論文提交日期牛堅(jiān)錢(qián)海鑫(教授)普通外科學(xué)肝癌的基礎(chǔ)與臨床2006年4月sil孫A封閉IGFIR蛋白表達(dá)治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究中文提要IGFIRmRNA表達(dá)水平為1059士68，無(wú)瘤栓組為435士38；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組IGF

2、IRmRNA表達(dá)水平為1203：t63，無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組為506：1：46，相應(yīng)的兩組之間有顯著差異。此結(jié)果表明IGFIRmRNA表達(dá)水平增高與臨床上腫瘤的侵襲特性有關(guān)。2采用免疫組化法檢測(cè)IGFIR蛋白在24例標(biāo)本中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)在667％(16／24例)的肝癌組織內(nèi)可見(jiàn)到IGFIR陽(yáng)性表達(dá)，IGFIR陽(yáng)性表達(dá)顆粒主要位于胞膜和胞漿，在同一組織標(biāo)本中IGFIR表達(dá)呈現(xiàn)均一性。IGFIR的表達(dá)在不同分化程度的肝癌有顯著差異(P005)。3利用R

3、TPCR技術(shù)檢測(cè)IGFIR基因在14株肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞株IGFIR的明顯表達(dá)。胎肝細(xì)胞系：L02沒(méi)表達(dá)。Westernblot顯示14株肝癌細(xì)胞株中IGFIR蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性，在105KD處可見(jiàn)到清晰的蛋白陽(yáng)性表達(dá)條帶。但在sK、Hep3B表達(dá)較弱。通過(guò)細(xì)胞免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)IGFIR陽(yáng)性表達(dá)顆粒主要位于肝癌細(xì)胞SMMC7721胞膜和胞漿，表達(dá)呈現(xiàn)均一性。由此可見(jiàn)，IGFIR在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制I

4、GFIR基因的表達(dá)將起到控制腫瘤生長(zhǎng)的目的。第二部分封閉人肝癌IGFIR的siRNA片段設(shè)計(jì)、篩選、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化l在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的siRNA研究中，有兩個(gè)關(guān)鍵的步驟，即如何篩選出最有效的針對(duì)目標(biāo)基因的siRNA片段，并使其高效轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)和表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)wwwambiontom網(wǎng)站的siRNA設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)針對(duì)IGFIR的特異性siRNA。2質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取及鑒定：采用DH5大腸桿菌為

5、工作菌，制備感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA，并經(jīng)酶切鑒定以備轉(zhuǎn)染使用。3轉(zhuǎn)染效率與脂質(zhì)體的量和質(zhì)粒量存在交互作用。在24孔板中以Lipofectarnine200031tl，質(zhì)粒量10ug時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到95％以上。在24孔板中，以LipofectamineReagentPlusl5p1，質(zhì)粒量0Bug時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到65％。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5106細(xì)胞來(lái)說(shuō)，電壓200V，電容700／aF，質(zhì)粒4ug時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高68％。L