人源輪狀病毒基因在胡蘿卜中的表達.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus,RV)屬于呼腸孤病毒科(Reovrridase)輪狀病毒屬(Rotaviras)，是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒傳染性重癥腹瀉的主要病原。目前疫苗預(yù)防仍然是控制此病的最有效措施。轉(zhuǎn)基因植物疫苗可以改變傳統(tǒng)疫苗的接種方式和生產(chǎn)手段，而且能夠降低疫苗的生產(chǎn)成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。VP7是輪狀病毒主要的外殼蛋白和中和抗原，在誘導(dǎo)中和抗體方面和在抗體保護性免疫中發(fā)揮重要作用，VP6在輪狀病毒蛋白中含量最豐富，能誘導(dǎo)產(chǎn)生I

2、gG抗體和IgA抗體，與保護性免疫有關(guān)。VP4屬于蛋白酶敏感蛋白，是一種中和抗原，在病毒的致病性方面可能起重要作用，因此，用人源輪狀病毒VP7，VP6和VP4基因作為抗原基因是研制可食用性疫苗的最佳選擇。在此之前楊艷梅和郭榮通過試驗已成功地得到了一個轉(zhuǎn)VP7基因和一個轉(zhuǎn)VP6基因胡蘿卜的株系，但沒有在蛋白水平上進行檢驗，況其“獨生子”的遺傳背景單一，可選擇性差，所以有必要繼續(xù)進行輪狀病毒基因?qū)}卜的轉(zhuǎn)化，以得到在蛋白的水平上表達量較高

3、的株系。 本試驗在研究胡蘿卜(DaucuscarotaL.var.sativa)組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了以下胚軸為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將輪狀病毒基因VP7，VP6，VP4轉(zhuǎn)入胡蘿卜獲得了T0代植株。又通過對T1代植株的有性雜交獲得了同時含有VP7基因和VP6基因的T2代胡蘿卜。主要研究結(jié)果如下： 1.建立了完整的胡蘿卜再生體系，確定種子的最佳滅菌條件是1﹪AgNO3振蕩消毒15-20分鐘；黑田五寸的

4、最適愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基及激素組合為B5+0.1mg/L2，4-D+0.2mg/LKT；MS培養(yǎng)基有利于再生植株的生根；再生植株在培養(yǎng)瓶中的煉苗時間以7～10天為宜。 2.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將VP7、VP6和VP4基因轉(zhuǎn)入胡蘿卜，同時建立了高效的胡蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化體系。7～9天苗齡的胡蘿卜下胚軸侵染農(nóng)桿菌10-20分鐘，共培養(yǎng)2～3天后，轉(zhuǎn)入附加80mg/LKan+500mg/LCarb的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，待形成抗性愈傷后，繼代到附加120

5、mg/LKan+300mg/LCarb的植株再生培養(yǎng)基上，50天后可得到Kan抗性苗。 3.分別對VP7，VP6和VP4的卡那抗性植株70，68，68棵進行PCR檢測，PCR陽性率分別為30﹪，22﹪和21﹪；對經(jīng)PCR檢測的陽性植株進行Southern-blot和RT-PCR檢測，結(jié)果表明輪狀病毒VP7，VP6，VP4基因已整合到胡蘿卜基因組中并能夠正常轉(zhuǎn)錄。 4.對T1代的轉(zhuǎn)VP7基因和轉(zhuǎn)VP6基因的胡蘿卜進行有性雜